叶绿酸铜钠对结直肠肿瘤抑制作用的实验研究

[摘要] 目的：研究叶绿酸铜钠(CHL)对DMH (1，2-二甲基肼二盐酸盐)诱导的小鼠结直肠肿瘤的抑制作用。方法：80只幼鼠（4~5周）随机分为阴性对照组(NC组)、阳性对照组(DMH组)、CHLA组和CHLB组。DMH组和CHL组背部皮下注射DMH诱癌；NC组背部皮下注射生理盐水作对照。以CHL灌胃处理CHLA和CHLB组动物。处死小鼠后，解剖小鼠结直肠，固定，观察肿瘤发生情况，免疫组化染色示PCNA、Ras-p21及caspase-3等细胞增殖及凋亡相关因子的表达情况。结果：两CHL干预组小鼠结直肠肿瘤发生率与DMH组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；但其平均每鼠荷瘤数及结直肠癌百分率都显著低于DMH组(P<0.05)；不同时间CHL干预对小鼠肿瘤的抑制作用差别不明显(P>0.05)；两CHL干预组小鼠肠黏膜PCNA、Ras-p21蛋白表达水平均显著低于DMH组(P<0.01)；caspase-3 表达水平在DMH 和CHL组间无明显差异（P>0.05）。结论：CHL在诱癌起始阶段和始发后阶段给药均可抑制DMH诱导的小鼠结直肠肿瘤的发生，降低每鼠平均荷瘤数及肠癌百分率，这可能与其下调结直肠黏膜PCNA，Ras-p21水平，从而间接调控细胞增殖和凋亡平衡有关，CHL有望成为预防结直肠癌的理想化学制剂。

[关键词] 叶绿酸铜钠；小鼠；结直肠肿瘤

[中图分类号] R735[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）07（b）-020-03

Restraining effect of Sodium Copper Chlorophyllin on colorectal cancer of mice

WANG Qing,WANG Xin-ming

(Department of Anatomy,Weifang Medical College,Weifang 261042,China)

[Abstract] Objective: To research possible restraining effect of sodium copper chlorophyllin (CHL) on DMH-induced colorectal tumour in mice.Methods: 80 mice (male) (4~5 weeks ) were randomly divided into negative control group (NC group, in which the mice were given hypodermic injection of physiological saline), DMH group, CHLA group and CHLB group(the mice in these three groups were given hypodermic injection of DMH on the back，those in CHL group were given CHL intragastric administration).The whole colon and rectum were dissected to observe shape and distribution of large bowel tumour,marked with number, fixed and immunohistochemistry stains. Results:There was no significant difference between incidence of colorectal carcinoma of CHL group and DMH group(P>0.05). While incidence of colorectal cancer, average number of tumour, and the percentage of carcinoma in these tumours of CHL group were all significantly lower than those of DMN group (P<0.05). There was no significant difference between effect of CHLA group and CHLB group (P>0.05). In further mechanism exploration, PCNA and Ras-p21 expression level of CHL treated groups were both found to be elevated than those of DMH group(P<0.01), while expression level of caspase-3 were found to be unchanged by CHL(P>0.05) treatment.Conclusion:CHL can suppress the incidence of DMH-induced colorectal tumour in mice, whether it is given at the initiation or in the middle of DMH treatment. This effect may be partly attributed to CHL"s reducing effect on PCNA and Ras-p21 expression and the subsequent suppression effect on excessive cell proliferation.

[Key words]Sodium Copper Chlorophyllin; Mice; Colorectal cancer

恶性肿瘤严重危害人类健康，长期以来，人们一直在寻求高效低毒的肿瘤防治药物。近年来，叶绿素在肿瘤防治中的相关研究及应用日益受到国内外学者和临床工作者的关注。

叶绿素(chlorophyll)是广泛存在于绿色植物中的一组脂溶性镁卟啉络合物，经过化学修饰可转化成稳定的水溶性衍生物-CHL，其为含有四个吡咯环的二氢卟吩结构，对人体毒性小，易吸收，动物试验中，叶绿素及其衍生物具有抗诱变活性及抑制肿瘤细胞的作用。它可以降低多种化学诱变剂诱导的微核形成[1，2]，减少微核细胞的比例[3]，抑制癌细胞增殖[4，5]，通过改变细胞分化标志物的表达而限制癌的侵袭和转移[6]，对化学致癌剂诱导的肝、肺、肠、乳腺，皮肤等肿瘤有抑制作用[7-9]。有关CHL用于结直肠癌的预防研究国内外有关报道还很少。本实验中用化学致癌剂诱导小鼠结直肠肿瘤，并在诱癌的不同阶段给予CHL，观察其对结直肠肿瘤的抑制作用。

1材料与方法

1.1 动物分组及处理

雄性昆明种小鼠80只(4~5周)，体重（18.0±1.9） g，由潍坊医学院实验动物中心提供，随机分为4组。正常对照（NC）组(10只)：每周1次背部皮下注射生理盐水3 ml/kg作对照；DMH组(30只)：按30 mg/kg体重的剂量每周1次背部皮下注射DMH溶液；CHLA组（20只）、CHLB组（20只）：每周1次背部皮下注射DMH 30 mg/kg诱癌，同时分别自实验第1、8周起，以1.0 mg/kg剂量的CHL隔日1次灌胃至实验结束。于实验第13周末颈椎脱臼处死于NC组、DMH组、CHLA组动物各5只；第20周末处死剩余的全部动物。解剖小鼠结直肠，观察肿瘤的形态及分布部位，计数肿瘤并测量其最大直径，计算肿瘤发生率，同时观察其他脏器有无转移灶发生。席卷从肛门至盲肠的整段大肠，固定。

1.2 免疫组化染色

常规石蜡包埋，切成厚5 μm切片，每隔50 μm取1片，行免疫组织化学染色(SABC法) ，检测PCNA、P21、caspase-3蛋白表达水平。滴加1∶200的一抗，4°C冰箱过夜。滴加生物素化二抗，室温20 min。滴加试剂SABC，室温20 min。DAB显色，苏木素轻度复染。PCNA，P21表达用肠肿瘤组织作阳性对照，caspase-3表达用试剂中所附阳性切片为阳性对照，同时用0.01 mol/L PBS替代一抗作为阴性对照。

1.3 统计学方法

实验数据用SPSS11.5统计学软件包处理：大肠肿瘤发生率、肠癌发生率用Fisher精确概率法，肠癌百分率和肿瘤分布部位用卡方检验，小鼠平均荷瘤数用方差齐性t检验、PCNA，P21，caspase-3表达用秩和检验。以上假设检验设定P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物和大体标本形态学观测

实验过程中NC组小鼠无死亡，70只诱癌小鼠中死亡3只，均死于灌胃过程中，小鼠死亡率为4.3%。最早于诱癌第10周发现DMH组部分小鼠出现肉眼血便，于第13周发现肉眼可见的肛门癌。诱癌第20周时肉眼可见结肠腔面多发肿瘤，大小不等，最大直径均值为1.5 cm，最小约1 mm，肿块大多无蒂，突出于肠腔，DMH组22只小鼠(22/25)发现肛门癌，最大的直径为1.6 cm，最小的为5 mm，多伴有火山口样溃疡，部分小鼠可见局部淋巴结肿大，但各组小鼠未见肿瘤转移灶。

2.2 CHL对小鼠肿瘤发生及对PNCA、Ras-p21及caspase-3蛋白表达的影响

两CHL干预组小鼠结直肠肿瘤发生率与DMH组相比无统计学上显著性差异(P>0.05);但其平均每鼠荷瘤数及结直肠癌百分率都显著低于DMH组(P<0.05)，且CHLA组和CHLB组之间比较时差异均无显著性(P>0.05)。CHLA组和CHLB组PCNA及Ras-p21蛋白表达均显著低于DMH组（P<0.01），caspase-3 表达水平在DMH 和CHL组间无明显差异（P>0.05）。但CHLA组和CHLB组之间比较时均无显著性差异(P>0.05)。

2.3免疫组化各指标观测结果

PCNA阳性染色仅限于细胞核，核呈棕黄色颗粒，在DMH组小鼠大肠组织中大多呈强阳性表达，经统计学分析，明显高于CHL组和NC组（P<0.01）（图1）；P21阳性染色位于胞浆和胞膜，正常小鼠大肠组织中无表达，在20周末时DMH组小鼠大肠组织中其表达明显高于CHL组和NC组（P<0.01）（图2）；caspase-3阳性染色位于胞浆和胞膜，在正常小鼠大肠组织中大多呈现阳性表达，位于肠腔面，形成凋亡细胞带，在DMH组小鼠大肠组织中大多散在表达，在肿瘤组织中不表达，但在其周围有表达较高。在第20周时两CHL干预组大肠组织caspase-3表达强度和DMH组之间比较无显著性差异(P>0.05)。

3讨论

叶绿素在医药上的研究始于20世纪20年代，人们发现叶绿素及其衍生物具有促进造血功能，促进组织愈合、抗微生物、保肝等作用，并用于一些疾病的临床治疗。而其抗诱变抗肿瘤研究则于1979年Lai等[10]在实验中证实，其后越来越多的研究显示CHL对多种诱变剂和致癌物都有较强的抗诱变作用，与多种动物肿瘤的发生呈负相关，但其抗肿瘤作用机制目前并不十分明确。

本研究未观察到CHL对小鼠肠肿瘤的分布部位及肿瘤发生时间的显著性影响，这也可能与诱癌过程中观察的样本、时间点不够多有关，有待进一步研究明确。但在实验过程中发现，单纯诱癌小鼠(DMH 组)的PCNA蛋白表达水平显著高于正常小鼠，表明细胞增生活跃，而使用CHL干预后小鼠肿瘤组织中的PCNA蛋白表达水平明显下调，提示CHL具有调整细胞周期，降低细胞增生速率，从而使肿瘤细胞的早期生长受到抑制的作用。近年来研究证明，Ras-p21的高表达与细胞增殖有密切关系，是大肠癌的化学预防研究中的一个有价值的生物学标志物 ，而我们实验结果也表明，CHL能明显抑制DMH诱导的p21高表达。caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，通过降解细胞内相应底物使细胞程序性死亡。据文献报道[11]，caspase-3在低凋亡率的肿瘤细胞中常不表达或表达减弱，大肠肿瘤组织中的表达明显低于正常组织，同时，凋亡指数也明显降低。提示它可能参与了细胞凋亡的调节机制，在大肠肿瘤恶变的过程中发挥作用，并与恶性程度关系密切。本研究表明，在NC组，caspase-3表达较高，主要位于肠黏膜的腔面，在其他部位无表达，在DMH组的肿瘤组织中caspase-3无表达，肿瘤周围组织中caspase-3表达较高，肠黏膜的腔面表达较低，在其他部位有散在表达。caspase-3在大肠组织中的表达在DMH组和CHL组无差别。表明CHL并不影响caspase-3途径的细胞凋亡，只是通过下调细胞增殖指数而抑制肿瘤的发生和进展。

鉴于上述研究结果，我们认为CHL具有良好的抑制结直肠肿瘤发生的作用，这与其抑制肿瘤细胞的增生、增殖有关。由于叶绿素来源丰富、其衍生物合成简单、稳定性较好，比化学合成的肿瘤抑制剂更具安全性和实用性，易于为人体吸收，因而叶绿素及其衍生物有望成为一种经济、理想的肿瘤化学预防剂。

[参考文献]

[1]Garcia, Lopez, Altamirano. Effect of chlorophyllin on chromium trioxide-induced micronuclei in polychromatic erythrocytes in mouse peripheral blood[J]. Mutation Research, 2001, 496(2): 145-151.

[2]Bez GC, Jordao, Vicentini,et al.Investigation of genotoxic and antigenotoxic activities of chlorophylls and chlorophyllin on the cultured V79 cells[J]. Mutation Research, 2001, 467(5):139-145.

[3]Diaz-Barriga Arceo S, Hernandez-Ceruelos A, Madrigal-Bujaidar E，et al. Inhibitory effect of chlorophyllin on the frequency of micronuclei induced by sodium nitrite in mice[J]. Phytother Res, 2002,16(8): 754-757.

[4]Chiu LC, Kong CK, Ooi VE. Antiproliferative effect of chlorophyllin derived from a traditional Chinese medicine Bombyx mori excreta on human breast cancer MCF-7 cells[J]. Int J Oncol, 2003,23(3): 729-735.

[5]丁小文，郑树，彭佳萍, 等 . 叶绿酸铜钠抗肿瘤作用的体外实验研究[J]. 中国病理生理杂志, 2004, 20(9)：1659-1663.

[6]Carter O, Bailey GS, Dashwood RH. The dietary phytochemical chlorophyllin alters E-cadherin and beta-catenin expression in human colon cancer cells[J]. J Nutr, 2004, 134(12 Suppl): 3441-3444.

[7]Meirong, Gayle, George, et al. Post-initiation effects of chlorophyllinand indole-3-carbinol in rats given 1,2-dimethylhydrazine or 2-amino-3- methyl- imidazo[4,5-f]quimoline[J]. Carcinogenesis, 2001, 22(2): 309-314.

[8]Jiang YG, Chen JK，Wu ZL, et al.Chemoprotetion by chorophyllin in vivo: inhibition oflung tumorigenesis in mice[J]. US CJMI, 2001, 3: 94-98.

[9]Dashwood, Xu ,Orner, et al. Colonic cell proliferation, apoptosis and aberrant crypt foci development in rats given 2-amino-3-methylimidaz[J]. Eur J Cancer Pre, 2001, 10(2): 139-145.

[10]Lai CN. Chlorophyll: the activation of caecinogens in vitro[J].Nutr Cancer, 1979,1:19-21.

[11]张为强, 邓甬川, 陈丽荣, 等. CPP32(caspase-3)在大肠腺瘤和腺癌中的表达及其与预后的关系[J]. 实用肿瘤杂志, 2001, 16(5):341-343.

（收稿日期：2008-03-07）

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

推荐访问:直肠 肿瘤 抑制 实验研究 作用