PI3K抑制剂,综述和新开发策略

　PI3K 抑制剂 综述和新的开发策略

　导 读

　磷脂酰肌醇 3-激酶( phosphoinositide 3-kinase，PI3Ks) 途径是人类癌症中最常被激活的信号通路之一，几乎介导 50%的恶性肿瘤的发生。PI3K 是一种胞内脂质磷酸激酶，催化肌醇第 3 位的磷酸化。PI3K 是由一个催化亚基 p110 和一个调节亚基 p85 构成的异二聚体，具有 SH2 结构域 (Src Homology 2 domain)。通过 SH2 结构域，PI3K 可与其它蛋白的磷酸化酪氨酸残基结合，从而被募集到质膜，使其催化亚基靠近质膜内小叶的磷脂酰肌醇。在膜脂代谢过程中，PI3K 催化 PI-4-P(PIP)生成 PI-3,4-P2(PIP2)，催化PI-4,5-P2(PIP2)生成 PI-3,4,5-P3(PIP3)。这些与膜结合的 PI-3-P 为多种信号转导蛋白提供了锚定位点，进而介导多种下游信号通路。例如活化 Akt/PKB、mTOR 激酶等下游通路。

　根据 PI3K 的结构特点和底物分子可将其分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 3 类。

　Ⅰ型分为 IA型和 IB 型， IA 型由受体酪氨酸激活，根据催化亚基 p110 的不同又可分为 PI3Kα、PI3Kβ 和 PI3Kδ 3 个亚型；IB 型即为 PI3Kγ 亚型。IA 型 PI3K 与肿瘤的发生发展密切相关，其中编译 PI3Kα 的基因 PIK3CA 是肿瘤中最常见的突变，PIK3CA 突变后在异常激活 PI3Kα 的同时，还能抑制抑癌基因 PTEN 的表达，因此 PI3Kα 成为抗癌药物研发中极为重要的靶点

　 目前，已有许多 PI3K 抑制剂批准上市或进入临床研究。泛 PI3K 抑制剂，如 buparlisib、pictilisb (GDC-0941)、copanlisib 等，泛 PI3K 抑制剂可以作用于所有 I 型的 PI3K 亚型，因此副作用与毒性较大，使得它们的临床进展缓慢。选择性作用于某个 PI3K 亚型的抑制剂具有更小的毒副作用，已有部分选择性 PI3K 抑制剂获批上市。Alpelisib 是 FDA批准的第一个 PI3Kα 抑制剂用于乳腺癌治疗，当 Alpelisib 靶向 PI3Kα 时，观察到此药

　可以有效地降低特定突变组合的信号强度。虽然该药被归类为 PI3Kα 特异性药物，但通常会观察到严重的浓度依赖性副作用和耐药性。主要原因是该药物和以前开发的药物一样，都是 ATP 竞争性的，而 PI3K 各亚型之间的 ATP 结合位点几乎相同，当给药浓度增加，不可避免地对其它亚型产生抑制作用。因此降低副作用，对 PI3K 抑制剂的开发与癌症治疗具有重要意义。

　本文作者 Ruth Nussinov 回顾了 PI3K 抑制剂，基于其课题组前期研究概述了 PI3Kα 激活的机制、致癌突变及其联合突变。最终提出了两种新的可能的 PI3Kα 抑制剂开发策略。(1) PI3Kα 正构和 别构抑制剂 的联合使用；(2) 开发挽救突变位点的别构抑制剂。▉ ▉ PI3Kα 的 激 活 机 制 PI3K 激活发生在质膜上，它是通过与 RTK、RAS 和膜上 C-末端的磷酸化基序相互作用而介导的。如下图展示了突变位点导致 PI3K 激活的过程。

　 上图 A：热点突变 E542K 和 E545K 模拟 RTK 在 PI3Kα 的解除自抑制中的作用机制，这一作用暴露了 PI3Kα 活性位点。H1047R 模拟了 RAS 在 PI3Kα 激活过程的作用机制。这两处热点突变常伴随 E453Q/K、E726K 和 M1043V/I 等弱突变共同激活 PI3Kα。大多数弱突变都远离 p85α 亚基的自抑制结构域 nSH2 和催化位点，推断它们可能在激活PI3Kα 时起别构位点作用。

　图 B：热点突变（深色部分）主要发生在螺旋域和激酶结构域，弱突变发生在 ABD 和C2 结构域的表面。ABD 和 C2 中的 iSH2 结构域在激活的 PI3Kα 结构中活跃表达。

　图 C：含有自抑制区域的 nSH2 的 PI3Kα 的结构处于非活性构象图 D：PI3Kα 在移除 nSH2后并伴有 a-loop 时处于激活状态。图 E：移除 nSH2 结构域的 PI3Kβ 只具有部分活性。说明 PI3Kβ 被 nSH2 和 cSH2 同时抑制。这意味着 PI3Kα 和 PI3Kβ 亚型自抑制区域不同。

　受到 KRas4B 共价抑制剂开发过程的启发，可以尝试发现新的 PI3Kα 的别构口袋，来开发 PI3Kα 的别构抑制剂，在维持抑制活性的同时提高化合物对 PI3K 亚型的选择性。

　▉ ▉ PI3Kα 与 Alpelisib 的 相 互 作 用 解 析

　PI3K 的 ATP 结合位点位于激酶结构域的两个片段之间，由铰链隔开。I 型 PI3K 的ATP 结合位点高度同源，仅在边缘处有几个残基不同。这些残基可分为分为两个区域，第一个是位于铰链附近的四个残基组成的可变区，第二个是位于 P-loop 处的较小的可变区。对于 PI3Kα，铰链区可以提高 ATP 抑制剂的选择性。如图，Alpelisib 结合激酶结构域中的 ATP 口袋，并与 P-loop 和铰链区相互作用。其中与 Alpelisib 接触的残基大多是保守的，只有铰链区五个可变残基（852RNSH855 和 Q859）。在这里，作者重点研究两个残基 R852 和 Q859，因为其他三个残基（NSH）的侧链暴露于溶

　剂中，几乎不与 Alpelisib 的相互作用。PI3Kα 的 Q859 与 Alpelisib 形成双氢键（图C），这表明并证实了其在亚型选择性中的重要性。此残基在 PI3Kβ（D856）和 PI3Kδ（N836）中变得更短，而 PI3Kγ 中的 K890 仍然足够长，足以与 Alpelisib 进行氢键相互作用。PI3Kα 中的 R852 与激酶结构域 N-lobe 中的 E798 形成盐桥，在 PI3Kγ（K831-E814）中观察到类似的盐桥。PI3Kγ 的 L829 还与 M762 和 W760 建立疏水相互作用。而 PI3Kβ 中 S849 由于较短，则完全没有类似的相互作用。

　这些结果表明，铰链区的结构与 Alpelisib 对 PI3K 的选择性有关。PI3Kα（~5 nM）的 IC 50 值最高，其次是 PI3Kγ（~250 nM），PI3Kδ（~290 nM）和 PI3Kβ（~1200 nM）。虽然，利用铰链区残基的差异设计高选择性的 PI3K 抑制剂取得一定进展，但是仍存在一些缺点。例如，人体中部分 PIP2 脂质以高亲和力锚定在细胞膜中，因此底物结合位点较浅，深埋于细胞膜的蛋白质表面进一步限制了小分子的进入。

　这使得模拟 ATP 结构，作用于铰链区的小分子抑制剂往往需要较高的给药浓度，随之而来的是脱靶效应带来的毒副作用。因此，寻找其它空腔并开发相应的抑制剂具有重要意义。

　 目前，一个非 ATP 类型的别构口袋已经被发现（PDB：4A55），然而该口袋尚不清楚其具体功能，作者认为该结合位点不太可能产生有效的别构抑制剂。基于片段的筛选，作者鉴定在 E542K 和 E545K 突变热点处具有磷酸肽结合作用的别构抑制剂口袋，并获得了满意的结果。这些变构口袋总结在上面图 A 和 B 中。此外，如上图 C 部分，在 ABD 和激酶结构域的 N-lobe 之间有一个口袋，该口袋较深，疏水性强，涉及的残基包括 ABD–RBD 接头中的 115–123 号残基，以及激酶域的 N-lobe 中的 699–715号残基和 840–845 号残基。靶向此口袋的抑制剂有望增强 ABD 和 iSH2 的的结合界面，从而稳定了 PI3Kα 的失活构象。

　▉ ▉ 开 发 PI3Kα 抑 制 剂 的 新 策 略

　 a| 别构抑制剂联合正构抑制剂 曾经，人们发现：转移性间变性淋巴瘤激酶（ALK）的 Cys 至 Tyr 突变（C1156Y）使它对 ATP 竞争的药物克唑替尼耐药。之后的 Lorlatinib 也由于 L1198F 的突变，导致了耐药性。然而，明显的 L1198F 变构突变却使 ALK 对克唑替尼重新敏感，携带这种突变的患者再次接受克唑替尼治疗，癌症相关的症状得到缓解。这里，L1198F就是挽救性突变，该突变重新分布了 ALK 构象集合，促进克唑替尼的结合状态。因此，一旦发生挽救性突变，就不需要相应的别构抑制剂。如果在该位置没有这种突变，则可以模拟开发相应的别构抑制剂，从而促进 ATP 结合位点上的可容纳药物的构象变化。因此，别构药物可以像别构突变一样重新激活活性位点，从而恢复正构药物的作用。

　别构药物与正构药物联合使用的概念并不新鲜，但在 PI3Kα 中尚未经过测试。别构药物通过改变构象封堵 ATP 竞争抑制剂，使正构抑制剂结合的更加稳定。或通过产生可成药的 PIP2 结合位点来克服 PI3Kα 耐药性。

　b| 挽救性突变位点抑制剂的开发 如何确定此类突变的位置？早些时候作者研究 von Hippel–Lindau 肿瘤抑制蛋白（pVHL）的过程中，他们使用了分子动力学模拟，寻找蛋白质未结合状态中最不稳定的区域来确定可能的候选残基，这些残基减弱了两个结构域之间的连接，同时，在域间界面和域中设计了几个稳定性的突变。结果表明，在缺氧诱导因子（HIF）结合位点的疾病突变体 Y98N 破坏了 pVHL 的稳定性，并降低了其对 HIF 的亲和力，模拟表明 pVHL 的稳定性和结合力是别构调节的。因此，可以寻找稳定 pVHL 而远离结合位点的别构突变口袋。基于蠕虫的 pVHL，作者通过设计取代片段来稳定 Y98N 突变体，降低了 pVHL 与 HIF 的复合物的结合能，以此稳定了 pVHL，从而拯救了 pVHL–HIF的亲和力和功能。

　同样的，在 PI3Kα 中，挽救突变可以通过别构位点控制改变构象，从而在不增加其浓度的情况下提高 ATP 竞争药物对其结合位点的亲和力。激酶结构域的 P-loop 的突变位点可能是有希望的靶点。对于 PTEN 肿瘤抑制剂，也可以考虑采用这种策略。

　此外设计别构抑制剂的关键还包括识别变构位点，包括隐性别构口袋。别构抑制剂可以形象的描述为“锚”和“驱动”的双重作用。锚固定在一个别构口袋中，使 PI3Kα 在非性状态和活性状态之间的转换过程中构象保持不变，驱动程序则“拉动”或“推动”蛋白质原子（侧链或主链）并使受体进入药物结合状态。

　▉ ▉ 总 结

　PI3K 是癌症药物开发的热门靶点，发展至今已有许多 PI3K 抑制剂上市或进入临床研究阶段。泛 PI3K 抑制剂由于对亚型选择性较差，往往具有较大的毒副作用；选择性PI3K 抑制剂虽然在体外活性测试中有较好的亚型特异性，但是在体内仍然无法实现有效的选择性，使临床收益降低。本文主要介绍了与癌症密切相关的 PI3Kα，分析了其结构特征与自抑制构象，简要介绍可能实现选择性抑制作用的别构口袋，为 PI3K 抑制剂的研究提供了新的思路。

　参考资料：

　1.PI3K inhibitors: review and new strategies

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