天舒胶囊乙醇提取过程的近红外光谱快速测定方法研究
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[摘要]基于近红外光谱法，采用偏最小二乘法（PLS）分别建立了天舒胶囊乙醇提取过程固含量和阿魏酸浓度的定量校正模型，结果显示，固含量校正集和交叉验证集模型的相关系数（R2）分别为0.967 301和0.947 726，校正集误差均方根（RMSEC）为0.054 7，交互验证集误差均方根（RMSECV）为0.069 8；阿魏酸校正集和交叉验证集模型的相关系数（R2）分别为0.986 879和0.962 243，RMSEC为1.402 6，RMSECV为2.400 2。采用所建模型进行在线分析，固含量和阿魏酸的预测结果与实测值的相关系数（R2）为0.993 3和0.991 6，预测误差均方根（RMSEP）分别为0.039 3和1.669 3，预测平均相对偏差（RSEP）分别为3.49%和3.58%。结果表明，该文所建模型可用于天舒胶囊乙醇提取过程固含量和阿魏酸浓度的快速测定。
[关键词]近红外光谱；偏最小二乘法；提取过程；天舒胶囊；阿魏酸
[Abstract]Based on the near infrared spectroscopy， partial least square （PLS） method was used to respectively develop the quantitative calibration models to fast measure the contents of the total solid and ferulic acid in extraction process of Tianshu capsule extracts. The results showed that in the quantitative model of solid content， the correlation coefficients （R2） of calibration set and cross validation set were 0.967 301 and 0.947 726. The root-mean square error of calibration set （RMSEC） was 0.054 7 and root-mean square error of cross validation set （RMSECV） was 0.069 8. Besides， in the quantitative model of ferulic acid， the correlation coefficients （R2） of calibration set and cross validation set were 0.986 879 and 0.962 243. RMSEC was 1.402 6 and RMSECV was 2.400 2. When the established models were applied to on-line monitoring， the correlation coefficients of predicted results and measured values for total solid content and ferulic acid were 0.993 3 and 0.991 6； root-mean square error of predicted value （RMSEP） was 0.039 3 and 1.669 3 respectively； mean relative deviation of predicted value （RSEP） was 3.49% and 3.58%. The results indicated that the established models can be used to fast measure the contents of the total solid and ferulic acid in extraction process of Tianshu capsule extracts.
[Key words]near-infrared spectroscopy； partial least squares； extraction process； Tianshu capsule； ferulic acid
提取工艺是中药生产的关键环节之一，是大多数中药制药过程的起点，决定药材的利用率。目前，提取工艺的质量控制主要依靠工艺参数和传统的质量分析方法，难以表达生产过程中复杂的理化变化。在实际生产中，提取时间往往是固定的，缺乏考虑因药材质量差异和工艺参数波动导致的提取终点提前或滞后而造成批次间质量的不稳定，能源、时间的浪费以及药材利用率的降低等。故研究并规范中药生产过程中指标成分含量的快速测定方法，将有助于解决药品生产关键工艺环节的质量控制问题，从产品的源头上解决中药产品工艺和成分的稳定性、可靠性问题，对中药工业技术进步和产品质量提升具有重大现实意义。
近红外光谱 （near infrared spectroscopy，NIR） 技术作为一种快速的过程分析技术，具有分析快速，样品处理简单，无需试剂消耗等特点[1-2]。近年来，已经越来越多地被应用于中药研究中，如药材产地鉴别[3-4]、有效成分含量测定[5]、中药纯化过程分析[6]、制药过程的在线检测和监控[7]等。从近年来研究进展看，NIR技术是最有希望在中药生产过程实现在线检测及质量控制的过程分析技术之一。
天舒胶囊是江苏康缘药业股份有限公司的独家产品，是在《宣明论方》中大川芎方基础上研究开发的现代中药制剂，具有活血通络、息风止痛之功效，临床主要用于血瘀所致血管神经性头痛即偏头痛，对紧张性头痛、颈性眩晕所致头痛也有一定的治疗作用[8]，天舒胶囊收载于2010年版《中国药典》，由川芎、天麻2味药材合并提取而成。现代研究表明，川芎主要成分为阿魏酸，具有抗血小板凝集、抗血栓、抗菌、消炎等功效[9-10]；天麻中主要活性成分天麻素具有治疗眩晕、头痛等生物活性[11-12]，阿魏酸和天麻素为天舒胶囊中主要活性成分。而在天舒胶囊的醇提取液中阿魏酸的含量相对较高，有利于NIR技术进行精确的在线检测。因此，本研究选择阿魏酸浓度和固含量为在线检测的质控指标。
本研究尝试将NIR技术引入天舒胶囊生产的醇提取过程，实现对质量控制指标固含量和阿魏酸浓度的实时监测，通过对近红外光谱信息与质控指标检测值之间的计算解析，采用偏最小二乘法建立川芎、天麻合并醇提取过程的定量校正模型，实现提取过程固含量和阿魏酸浓度的快速检测，为实现天舒胶囊醇提取过程在线质量监控提供实验依据。
1 材料
Luminar 5030 型 AOTF 近红外光谱分析仪（美国 Brimrose 公司），配套使用 SNAP 光谱采集原件和 CAMO 化学计量学软件；U3000 型高效液相色谱仪（美国 Cohesive Technologies 公司）；Ultimate Mate 3000 型检测器（美国 Cohesive Technologies 公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学技器有限公司）；BP211D 型1/1万电子天平（德国 Sartorius）；BT25S 型1/10万电子天平（德国 Sartorius）。
川芎天麻合并醇提取样品（江苏康缘药业股份有限公司生产车间），阿魏酸（中国食品药品检定研究院，批号110773-201313，纯度99.6%），乙腈（色谱纯，TEDIA公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 样品收集
跟踪天舒胶囊生产过程，从醇提取回流开始至醇提取过程结束，每隔3.5 min取样1次，每批取样17个，共取样8批，7批用于建立模型，1批用于模型验证。
2.2 近红外光谱采集
用Luminar 5030 型近红外光谱分析仪在线采集天舒胶囊川芎、天麻醇提取过程样品的近红外光谱，光谱采集方式为投射法，光谱扫描范围1 100～2 300 nm，波长增量2 nm，扫分辨率2 nm，描次数300次，光程2 mm，每个样品采集3张光谱，取平均光谱值作为样品的近红外光谱。
2.3 固含量的测定
取烘干至恒重的蒸发皿（称重X0），取样品约10 mL至蒸发皿中，称重X1，水浴蒸干，水浴蒸干后于105 ℃常压干燥箱中干燥至恒定质量，取出，于干燥器中冷却30 min，迅速称重X2。固含量按下式计算。
固含量=X2-X0X1-X0×100%
2.4 阿魏酸含量的测定
2.4.1 色谱条件 Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80），流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长322 nm，进样量10 μL。
2.4.2 标准曲线的绘制 精密称取阿魏酸对照品17.67 mg（纯度99.6%），置100 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为176.0 mg·L-1的阿魏酸对照品溶液。分别稀释0，2，4，8，16，32倍，进样分析。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程为Y=0.979 2X-0.258，r=0.999 9，在5.5～176.0 mg·L-1线性关系良好。
2.4.3 供试品溶液制备 样品于12 000 r·min-1离心10 min，取上清液即得。
2.5 数据处理方法与模型性能评价指标
在最佳光谱预处理方法筛选结果的基础上，选择合适的建模波段，采用偏最小二乘法（PLS）分别建立固含量和阿魏酸2个质量控制指标与近红外光谱数据之间的定量校正模型，以校正集和交叉验证集模型相关系数（R2），校正集误差均方根（root mean square error of calibration，RMSEC）和交互验证集误差均方根（root mean square error of cross validation，RMSECV）为指标进行模型优化，以外部预测结果与实测值的相关系数（R2）、预测误差均方根（root mean square error of prediction，RMSEP）和预测相对偏差（RSEP）为指标考察模型预测准确性。其中RMSEC和RMSEP的大小与样品质量控制指标值相关，二者的值越小、越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高；RMSECV可作为选择主因子数的评价指标，最佳主因子数通常选择在上述参数值最小的地方。
3 结果与讨论
3.1 质量控制指标测定结果
根据2.3和2.4项下方法分别测定7批校正集和1批验证集样品的固含量和阿魏酸含量，川芎、天麻合并乙醇提液样品固含量和其中阿魏酸含量分布见表1。
3.2 近红外光谱定量分析模型的建立
3.2.1 异常点的剔除 由于波长的漂移、操作误差、实验环境等变化，可能导致样品光谱出现异常，从而引起模型精度的下降，故对异常点的判断和去除是提高模型性能的必要步骤。本研究主要根据三维空间分布值（influence）和线性相关性（correlation）进行对照检验，剔除异常点，下文以阿魏酸为例进行说明，见图1。Influence是指图1中的三维空间分布图，由于定量分析的样品为同类样品，它们在主成分空间会因光谱性质的相似性而分布的相对集中，而远远偏离此区域的样品则具有较高的Residual残差值，可视为异常值，如图1（A）中的点32，49，87。Correlation是指图1的线性回归图，图中横坐标是检测值，纵坐标是PLS回归计算过程中交互验证得出的预测值，紧邻回归线分布或分布于回归线上的点，表明其对应的样品预测值与实测值接近或相同，而远离回归线分布的点，可视为异常点，如图1（B）中的点32，87。综合考虑，将样品32，49和87视为异常样品，不参与模型的建立。
3.2.2 光谱预处理方法的筛选 适当的光谱预处理方法能够有效地消除背景噪音及特定物理因素的干扰，提高谱图与化学成分之间的相关性，故须对光谱的预处理方法进行筛选。本实验比较了原始光谱和不同光谱预处理方法，结果见表2。通过比较分析，固含量建模过程的最佳光谱预处理方法是原光谱，而阿魏酸建模过程的最佳光谱预处理方法为一阶导数加9点平滑。
3.2.3 波段的选择 选择合适的光谱波段进行建模，既能最大程度的利用光谱中的有效信息，又能消除噪声等因素的影响。几组光谱波段下建立的固含量和阿魏酸的定量模型指标见表3。通过比较分析，固含量和阿魏酸的最佳建模波段均为1 100～2 300 nm。
3.2.4 定量校正模型的建立 在异常点判断和最佳光谱预处理方法筛选结果的基础上，选择合适的建模波段，运用留一交叉验证法（leave one out cross-validation）建立固含量和阿魏酸的PLS定量校正模型。结果得到，以固含量为质控指标建立PLS定量校正模型的最佳光谱预处理方法是原光谱，最佳建模波段为1 100～2 300 nm；以阿魏酸为质控指标建立PLS定量校正模型的最佳光谱预处理方法是一阶导数加9点平滑，最佳建模波段为1 100～2 300 nm。校正集样品的固含量和阿魏酸的预测值和实测值的相关性图分别见图2。
3.3 模型的验证
利用所建立的固含量和阿魏酸近红外定量测定模型对验证集样品进行预测，模型对验证集固含量和阿魏酸的预测值与实测值的线性相关性见图3。验证集固含量和阿魏酸的模型预测值与实测值的相关系数（R2）分别为0.993 3和0.991 6，预测误差均方根（RMSEP）分别为0.039 3和1.669 3，预测平均相对偏差（RSEP）分别为3.49%，3.58%，均<5%，结果表明该建模型可用于中药实际生产过程中的实时监控。
4 结论
本研究建立了天舒胶囊乙醇提取过程中固含量和阿魏酸浓度2个质量控制指标的近红外光谱在线检测方法，所建模型及其对未知样品的预测结果显示，模型能够满足中药生产过程实时监控的精度要求。同时，值得注意的是，建模数据范围会限制模型的适用范围，故模型的范围越广越好。而该模型的光谱数据和质量控制指标数据都是在时间间隔相近的情况下获得的，故其对时间间隔相近的未知样品的预测效果相对较好。而在实际生产过程中，随着时间的推移，药材质量、提取设备性能、仪器性能、人为操作等可能存在一定的差异，此时，模型会因其建模样品缺乏代表性，导致对新样品的预测能力降低。因此，在后期数据积累的基础上对该模型进行实时更新可保证近红外模型在实际使用过程中的稳定性和预测精度。
本实验建立的近红外过程分析在线质量监控技术，操作方法简便、快速无损，有望推广应用于中成药提取过程中各质量控制指标的快速检测，为在线实时监控中药实际生产过程，保证最终成品质量的稳定均一奠定了良好的基础。
[参考文献]
[1]王宁， 傅春华， 周爱敏， 等. 近红外漫反射光谱法直接测定小儿消食片中总有机酸的含量[J]. 中国中药杂志， 2007， 32（15）： 1597.
[2]Xie Y， Song Y， Zhang Y， et al. Near-infrared spectroscopy quantitative determination of pefloxacin mesylate concentration in pharmaceuticals by using partial least squares and principal component regression multivariate calibration[J]. Spectrochim Acta A， 2010， 75（5）： 1535.
[3]范茹军， 秦晓晔， 宋岩， 等. 基于近红外光谱的淫羊藿定性鉴别及定量检测[J]. 中国实验方剂学杂志， 2010（13）： 85.
[4]吕丽娟， 郭永辉， 赵雅婵， 等. 基于谱学技术鉴别4种龙胆科"地格达"类蒙药材[J]. 中国中药杂志， 2015， 40（5）： 799.
[5]涂瑶生， 全智慧， 孙冬梅， 等. 近红外光谱法快速测定制川乌提取浓缩过程中单酯型生物碱[J]. 中草药， 2013， 44（7）： 839.
[6]陈雪英， 徐翔， 陈勇， 等. 红花提取物纯化过程的近红外光谱快速测定方法研究[J]. 中国中药杂志， 2012， 37（20）： 3062.
[7]吴莎， 刘启安， 吴亚男， 等. 近红外光谱对热毒宁注射液栀子萃取过程中的可行性分析[J]. 中国实验方剂学杂志， 2015（1）： 53.
[8]范秀凤， 郭澄. 天舒胶囊治疗偏头痛的作用机制与临床应用[J]. 中国药师， 2011， 14（10）： 1529.
[9]袁卓， 张军平， 杨萃. 阿魏酸对血管内皮细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞迁移的影响[J]. 中国中西医结合杂志， 2012， 32（2）： 229.
[10]王振， 刘新泳， 王静， 等. 川芎嗪阿魏酸类化合物药理作用的研究进展[J]. 齐鲁药事， 2011， 30（11）： 665.
[11]张奋国. 天麻素治疗眩晕症及偏头痛疗效观察[J]. 中医中药， 2012， 10（7）： 248.
[12]陈东丽， 陈旭东， 夏翠英. 天麻对大鼠脑缺血再灌注神经细胞凋亡的影响[J]. 中国实验方剂学杂志， 2011（3）： 148.
[责任编辑 孔晶晶]