75%乙醇消毒效力和使用时限验证研究
材料有高密度中纤板、钢板、无菌手套等。本文根据《药品GMP指南（无菌药品）》13.3章节的要求[1]，采用实验室消毒剂效力硬表面测试法以无菌手套为例验证75%乙醇对于常见菌种（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌）的杀灭效力，同时验证该消毒剂的使用时限，即在放置规定时间后对常见菌种的杀灭效力，确认采用75%乙醇能达到预期的消毒效果[2-4]。
1 材料与方法
1.1 材料培养基：无菌大豆胰蛋白胨琼脂（TSA）；稀释液：灭菌0.9%NaCl溶液；载体：无菌手套；中和剂：硫代硫酸钠20g/L，配制后灭菌待用。挑战菌株：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌。灭菌移液枪、生物安全柜、震荡器、无菌擦拭棉签、培养箱、无菌擦片、75%乙醇。
1.2 方法
1.2.1 菌悬液的制备取冻干黄色葡萄球菌菌种管，以无菌操作打开，用毛细管吸取l.Oml营养肉汤，轻轻吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.Oml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～ 24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于大豆胰蛋白胨琼脂培养基平板上（通过反复划线的方式使菌体分布于整个平板表面），置37℃培养18h～ 24h，得第2代培养物；按上述方法接种培养直至第4代培养物。
取菌种第4代的大豆胰蛋白胨琼脂培养基平板新鲜培养物（18～24h），精密吸取10.0ml稀释液加入平板内，使用无菌刮棒轻轻刮取琼脂表面的菌体。再用lO.Oml吸管将稀释移至另一无菌瓶中，向瓶中加入稀释液至lOOml，盖紧瓶盖后振摇（约80下），得均匀细菌悬浮。
用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度，得菌悬液。置4℃冰箱内备用，当天使用不得过夜。
同法配置铜绿假单胞菌、大肠杆菌菌悬液。
1.2.2 载体片制备取无菌手套，在载体上刻画出数块lcmxlcm的区域（每个区域视为一个载体片），吸取O.01ml107～108Cfu//ml的菌悬液接种到各确定的lcmxlcm区域上，并用接种环使菌液在表面充分铺展开来，自然条件下干燥30～40分钟，作为染菌载体片备用。
1.2.3 中和剂效力确认取两支试管，分别加入9ml硫代硫酸钠20g/L，一支加入1ml水作为中和剂毒性试验（Nc组），另一支加入1m175%乙醇作为中和剂中和效力测试试验（Nr组）；充分混匀，静置5分钟。再取一支试管，加入lOml水作为对照组（No）。
在三支试管中各放入一片接种过的载体片。静置10分钟后，将载体片上的微生物全部洗脱到试管中，震匀后进行系列稀释，进行平板计数。记录每个稀释度l.Oml样品的菌落数。选取一个合适梯度的读数，该梯度的两块平板的读数（记为a1和a2）都应处于30至300CFU之间。
按照公式计算：Nc、Nr或No=109io（a1+a2）/2xlO/d
其中：d=稀释液的稀释系数
Nc=1og10中和剂毒性测试中每个菌片上的菌落数
Nr=1og10中和剂效力测试中每个菌片上的菌落数
No=1og10对照组测试中每个菌片上的菌落数
接受标准：-0.3 各种菌种分别测试。 1.2.4 消毒效力测试步骤将75%乙醇均匀喷洒在载体表面作用5分钟，无菌棉签沾取中和剂之后进行擦拭，并将擦拭后的棉签折断投入预先分配好的Sml中和剂试管中，中和10分钟后，将棉签上的微生物通过震荡的方法（电动混合器20s，1500rpm）全部洗脱至试管中，充分震荡该试管，然后移取Iml到已标记过的培养皿中做平板计数，每一支试管均做两块培养皿，37℃，培养3天，作为消毒测试组（Nd）。抛弃那些长的太多不能计数的平板，将剩余的平板计数。 将0.9%NaCl溶液喷洒在载体表面作用5分钟，无菌棉签沾取中和剂之后进行擦拭，同消毒剂测试组操作，作为空白对照（Nc）。 计算方法同1.2.3项下：Ne（或Nd）= 109io（ai+ a2）/2xlO/d 其中： d=稀释液的稀释系数 Nc=1og10空白对照中每个菌片上的菌落数 Nd=1og10消毒剂测试中每个菌片上的菌落数 Log下降值=NC-Nd，若下降值超过了5，一律以>5来表示。 判断标准：在一定的接触时间内，消毒剂能够使挑战菌水平下降99.9%（下降3个对数单位），则表明该消毒剂能够作为进行日常消毒使用。 1.2.5 75%乙醇消毒存放效期驗证75%乙醇常温密封放置15天后，按照1.2.4法再验证消毒剂效力。 2 结果 2.1 中和剂效力测试结果 中和剂毒性试验、中和效力测试试验与空白组的差值均在-0.3至0.3之间，符合要求。硫代硫酸钠20g/L作为中和剂既能有效抑制消毒剂的杀菌性同时又不削弱微生物活力的恢复。 2.2 消毒剂效力测试结果 75%乙醇能够使挑战菌水平下降约5个对数单位，符合要求，能够作为进行日常消毒使用。 2.3 消毒剂存放时限效力测试结果 75%乙醇密封放置15天后，仍能够使挑战菌水平下降约5个对数单位，与0天相比基本无变化。 3 讨论 75%乙醇对常见菌的消毒效力符合要求，放置15天后消毒效力未受影响。本试验中所使用的中和剂必须对于获得的第2代培养物，将其密封后在4℃保存，时间不得超过6周。喷洒消毒剂时应保持喷洒次数、挤压喷瓶力度和喷洒角度一致以减少实验误差。喷洒消毒剂的量以消毒剂刚好可以覆盖住载体表面为原则，不宜过多和过少。 参考文献 [1]国家食品药品监督管理局药品认证管理中心.药品GMP指南（无菌药品）2010年版[S].北京：中国医药科技出版社，2010：292-297. [2]王红，廖馨涓，严东珍等.75%乙醇的消毒效果及稳定性研究[J]国际生物制品学杂志，2013，（4）：182-184. [3]姚芳龄.关于醋酸氯己定一乙醇消毒效果的检测与分析[J]医学检验与临床，2010，（1）：125. [4]王雅静，陈惠珍，王冰妹等.碘伏与碘乙醇消毒液杀菌效果的试验观察[J].中国消毒学杂志，2013，（11）：343-346.