虎杖苷抑制高糖引起新生鼠心肌细胞钙漏流的作用及其机制研究
材料与试剂
1～3 d SD大鼠乳鼠20只，从广东省实验动物中心购买，动物许可证号：SCXK（粤）2013-0002。虎杖苷由深圳海王生物有限公司提供；抗SERCA蛋白抗体（Ab1）、PLB抗体购于美国Alomone公司；蛋白质测定试剂盒购于Bio-Rad公司；ECL检测试剂盒购于Invitrogen公司；胶原酶Ⅱ购于Worthington公司；5-溴脱氧尿嘧啶和胰蛋白酶（Sigma，美国）；DMEM培养基（Gibco，美国）；新生牛血清（NBCS）为Gibco；Fluo-4 AM和H2DCFDA购于Invitrogen公司，其余无特别说明为国产分析纯。主要的实验仪器为：Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜（Zeiss，德国）。
1.2 方法
1.2.1 乳鼠心肌细胞的原代培养 采用胰蛋白酶消化的方法分离乳鼠心肌细胞[3]。取 1～3 d 龄SD大鼠，在无菌条件下开胸，采用眼科镊快速取下心脏并置于冰冷的PBS缓冲液中清洗3次。取心尖部组织剪为1 mm3碎块，再用PBS液清洗，以清除血细胞。加入0.08%濃度胰蛋白酶37℃水浴消化10 min，弃上清，剩余组织块中加入混合消化酶（0.08%胰蛋白酶加 0.04%～0.06%Ⅱ型胶原酶等量加入的混合液）置37℃水浴消化5～10 min多次，将各次消化制成的细胞悬液合并后，通过150目孔径的不锈钢网滤过。将细胞悬液接种于60 mm培养板中，采取差速法贴壁心肌细胞：37℃，5% CO2培养箱中孵育1 h，分离纯化心肌细胞。将纯化的细胞按0.8×105/m2～1.0×105/m2的密度接种于35 mm培养皿中。
1.2.2 分组 细胞被随机分成四组：对照组（Control）、高糖组（High glucose，HG）、虎杖苷组（polydatin，PD）和高糖+虎杖苷组（HG+PD）。对照组给予甘露醇25 mM，高糖组给予25 mM葡萄糖，虎杖苷组给予30 μM PD +25 mM甘露醇，高糖+虎杖苷组给予30 μMPD+25 mM D-Glu，培养48 h后进行钙信号检测和Western blot检测。
1.2.3 荧光染料的加载 在室温下避光下把钙荧光指示剂Fluo-4 AM（5 μmol/L）与细胞共同孵育8 min。染色后将细胞置于Zeiss LSM-780 倒置共聚焦显微镜系统的载物台上，并灌以台氏液。
1.2.4 钙火花的采集 采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜线扫描方式，在400倍镜下，选取合适的细胞、保持相同采样速率为3.84 ms/线，连续采集1000条线。在采集过程中放大倍数和采样速度应尽量保持一致，以方便后期的数据统计分析。激发光波长为488 nm，收集波长为505 nm以上的发射光。
1.2.5 ROS的检测 细胞内ROS水平采用2’，7’-dichlorodihydro fluorescein diacetate（H2DCFDA）荧光探针进行检测。在室温下将细胞和荧光探针（10 μM）共同孵育10 min。采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜面扫描的方式，激发光波长为488 nm，收集波长为505 nm以上的发射光。为了保持结果的可比性，荧光探针的加载条件和荧光的采集条件需要完全一致。
1.3 统计学处理
钙火花图像和ROS信号的处理及分析采用IDL 6.3（Research Systems，Inc.，Boulder，CO）软件进行分析[4]。数据分析采用SPSS 13.0统计学软件，统计方法为单向方差分析，方差齐时采用LSD法，方差不齐时组间比较采用Welch检验。统计结果以均数±标准差（x±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 虎杖苷抑制高糖导致的心肌细胞钙漏流
结果显示（图1B），高糖引起的心肌细胞自发钙火花发放频率显著增加，由对照组的（1.69±0.07）增加到高糖组的（4.26±0.27），（t=-1.309，P<0.01）；PD组稍微增加钙火花的发放频率（1.89±0.08），（vs 对照组：P<0.05）；通过给予PD治疗后可以抑制由高糖引起的钙火花发放频率，由HG组的（4.26±0.27）降为（2.48±0.15），（P<0.01）。对钙火花的形态特性进一步分析见图1C～F，高糖组钙火花的幅度（F/F0）减小（vs 对照组：2.19±0.03 vs 2.32±0.05，P<0.05），持续时程（full-duration of half maximum，FDHM）延长（vs 对照组：40.06±0.94 vs 32.41±1.57，t=2.152，P<0.05），而不改变钙火花的宽度（full-width of half maximum，FWHM）。
2.2 PD抑制高糖引起的心肌细胞钙超载
在细胞的染色条件和所有的采集参数保持一致，采用激光共聚焦线扫描的方式，对四组心肌细胞静息期细胞内钙水平进行检测。结果显示：高糖引起心肌细胞的静息钙水平显著性升高，从对照组的（50.12±2.24）（n=100）升高到（70.53±3.54）（n=125），（t=-3.727，P<0.01）。给予PD治疗后，高糖引起的心肌细胞钙超载得到有效恢复（61.28±3.31）（n=200）[vs高糖组的（70.53±3.54）（n=125），P<0.05]（圖2）。
2.3 PD恢复高糖引起的心肌细胞ROS增加
与对照组的荧光值（56.13±3.24）相比，高糖培养心肌细胞48 h后，高糖组心肌细胞产生的ROS水平显著增高（98.13±6.32，t=4.923，P<0.01）。当给予PD治疗后，HG+PD组的心肌细胞ROS显著降低（vs 高糖组：64.28±5.31，t=3.336，P<0.01），单纯的PD组则不影响心肌细胞的ROS水平。
2.4高糖抑制受磷蛋白PLB和SERCA 2a蛋白的表达
如图4B、C显示，与对照组相比，高糖使得PLB蛋白表达有所降低（0.77±0.05 vs 0.98±0.04，t=-1.995，P<0.05，n=5）；同时对SERCA 2a蛋白水平也有下调作用（0.58±0.05 vs 1.03±0.03，t=-3.988，P<0.01，n=5）；但是高糖对SERCA 2a蛋白的抑制作用更为明显，PLB/SERCA 2A蛋白的比值有所升高（1.31±0.11 vs 0.96±0.04，t=3.023，P<0.01，n=5）（图4D）。给予PD治疗后，PLB蛋白和SERCA 2a蛋白的表达有所恢复。
3 讨论
钙离子作为细胞第二信使，在心肌细胞的兴奋收缩偶联（E-C coupling）中起着不可或缺的作用。心肌细胞对钙离子复杂而又精细的调控，维持细胞内钙离子浓度的动态平衡，从而保证细胞正常的舒缩功能。一旦钙离子的动态平衡被打乱，心脏功能甚至结构都可能发生异常。糖尿病是胰岛素分泌相对或绝对不足，并以高血糖、高血脂为特征的代谢紊乱综合征。研究表明，高糖血症会导致晚期糖基化终末产物（AGEs）和活性氧化产物（ROS）的增加[5]、激活 RAS系统，致脂质、蛋白、核酸损伤，相应的氧化应激产物增多，另外，高糖可致抗氧化系统的相关酶活性如SOD、过氧化氢酶的活性下降[6，7]。长期高糖血症导致心肌细胞能量代谢异常通路激活、氧化应激压力增加和线粒体功能异常，引起心肌细胞钙超载，即静息期胞浆钙离子浓度升高，可能是导致心肌功能障碍的重要原因[8-11]。
虎杖苷，是从传统中药虎杖中提取的单体，具有抗血栓、抗氧化、降血糖、抗休克、调节蛋白激酶等广泛的生物学效应[12]。在本课题组之前的系列研究中发现，PD具有很好的心血管保护作用，可以减缓肥大、防治烧伤后心功能的损伤的功效[13，14]。本研究中发现，PD通过改变钙火花发放频率和钙火花形态学，显著抑制高糖引起的心肌细胞钙超载，进而减少肌浆网钙漏流的发生，增加钙稳定性，进一步丰富了PD在心血管保护中的作用机制。
引起心肌细胞钙超载的原因不是单一因素，肌浆网中的钙泵 SERCA 2a 活性和功能影响着钙回收的效果。有实验报道，心衰时SERCA 2a 活性明显下降，同时伴有Ca2+摄取减少，胞质内Ca2+聚集，影响心脏的舒张功能[15]。受磷蛋白对SERCA 2a起着调控的作用，PLB 在非磷酸化状态下抑制SERCA 2a的活性，从而抑制SERCA 2a摄取Ca2+，PLB磷酸化可逆转这一抑制作用[16]。当PLB/SERCA 2a比值升高时，SERCA 2a和Ca2+的亲和力下降，心肌细胞舒缩功能受损。在本研究中，我们发现，高糖刺激使得SERCA 2a和PLB表达均下降，但SERCA 2a降低更为显著，PLB/SERCA 2a比值升高，从而引起钙泵的功能受损，引起心肌细胞的钙超载。
近年来大量研究表明，氧化应激是糖尿病心肌病发生、发展的重要病理生理学基础，抗氧化可以抑制糖尿病心肌病的进展，改善心功能。本研究中发现，PD通过抑制高糖引起的心肌细胞ROS增加，恢复SERCA 2a和PLB表达水平，提示糖尿病心肌病时钙调节蛋白表达异常可能与氧化应激损伤增强有关。
綜上所述，糖尿病心功能障碍的一个重要机制是SR钙漏流增加及钙调节蛋白表达异常。虎杖苷可以减少高糖引起的肌浆网钙漏流，缓解心肌细胞钙超载，增加心肌细胞钙离子的稳定性；同时抑制氧化应激损伤、调节心肌细胞钙调节蛋白表达，增加心功能，从而起到心肌保护作用。对于糖尿病心肌病患者，虎杖苷减少心肌浆网钙漏流有可能是早期治疗糖尿病心肌病的一个新的靶点。本研究提示虎杖苷可以抑制糖尿病心肌病的进展，改善心功能，为糖尿病心功能障碍的临床治疗提供实验依据和新的思路。
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（收稿日期：2016-08-16）