贝那普利对自发性高血压大鼠心肌纤维化及心肌肿瘤坏死因子表达影响

[摘要] 目的:研究贝那普利在预防自发性高血压大鼠(SHR)心肌纤维化中的作用及对心肌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法:16只6周龄SHR分为实验组(SHR-con组)和药物干预组(SHR-ben组),7只同周龄WKY鼠为正常血压对照组(WKY组)。SHR-ben组给予贝那普利(10 mg•kg-1•d-1)灌胃12周,其余两组蒸馏水灌胃,均每日1次。颈动脉插管,测颈动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP),天狼猩红染色,计算机图像分析软件分析心肌切片的胶原容积分数(CVF)和心肌小动脉周围胶原面积与小动脉管腔面积比(PVCA/LA);偏振光显微镜观察Ⅰ、Ⅲ型胶原(像素表示),计算Ⅰ/Ⅲ型胶原之值,观察心肌纤维化程度;用冰冻切片(免疫组化法)观察心肌TNF-α表达。结果:喂养12周后与WKY组比,SHR-con组SBP和DBP明显升高,CVF、PVCA/LA、Ⅰ/Ⅲ胶原之值亦显著升高(P<0.01),TNF-α表达亦增多;而SHR-ben组各指标较SHR-con组均显著性下降(P<0.01),贝那普利有效降低SHR的SBP、DBP,亦使CVF、PVCA/LA、Ⅰ/Ⅲ胶原之值均明显下降,改善SHR左心室纤维化,且下调TNF-α表达。结论:长期应用贝那普利治疗可预防和部分逆转高血压大鼠心肌纤维化,其机制可能与贝那普利除能降低血压外,还能降低心肌局部TNF-α表达有关。

[关键词] 贝那普利; 自发性高血压; 心肌纤维化; 肿瘤坏死因子-α; 大鼠

[中图分类号] R542.23; R544.1; R-33[文献标识码] A[文章编号] 1671-7562(2010)01-0001-06

doi:10.3969/j.issn.1671-7562.2010.01.001

Effect of benazepril on myocardial fibrosis and the expression of 

tumor necrosis factor-α in spontaneously hypertensive rats

SUN Shao-xian1,2, LI Hai-tao1, DIAO Zeng-li1, ZHAO Hong1, WANG Man-li1

(1. Department of Cardiology, the Affiliated Hospital, North China Coal Medical College, Tangshan 063000, China; 

2. Department of Internal Medicine, Maternity & Child Care Center of Qinhuangdao, Qinhuangdao 066000, China)

[Abstract] Objective: To study the effect of benazepril on myocardial fibrosis and the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α) in spontaneously hypertensive rats(SHR). Methods: Sixteen SHRs were randomly divided into two groups:experiment group(SHR-con group) and medical intervenning group(SHR-ben group). Seven WKYs were as the normal hypertension controls(WKY group). SHR-con group were fed benazepril (10 mg•kg-1•d-1) for 12 weeks. The others groups were received distilled water. Systolic blood pressure(SBP) and diastolic blood pressure(DBP) were detected by a tube that was plugged into the carotid artery and were connected with electronic physiological polyconductor machine. Picrosirius red staining combined with computed myocardial fibrosis were employed to evaluate the collagen volume fraction(CVF), perivasular collagen area/luminal area ratio (PVCA /LA) and immunohistochemical staining evaluated TNF-α on ice slice expression in the left ventricular size tissue. Results: Compared with WKY group, the SBP, DBP, CVF, PCVA/LA and TNF-α expression(P<0.01) increased markedly in SHR-con group, while these targets had decreased in SHR-ben group compared with SHR-con group. Conclusion: Chronic administration of benazepril inhibits and regresses the development of myocardial fibrosis in SHR. Except for the decreasing the blood pressure, TNF-α may be involved in the reversal mechanism of myocardial fibrosis by benazepril.

[Key words] benazepril; spontaneous hypertension; myocardial fibrosis; tumor necrosis factor-α; rats

心肌纤维化是高血压研究中引人注目的问题,它容易导致心肌缺血、心律失常、心力衰竭等多种病理性后果,是心血管疾病发病率和死亡率的独立危险因素。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)是一种具有多种生物学效应的细胞因子,研究表明,TNF-α可由成熟的心肌细胞本身分泌产生并参与多种心脏疾病的病理生理过程[1]。TNF-a与心肌纤维化关系的研究更是当今心血管科学研究的一大热点。本实验以自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)为模型,以血管紧张素转换酶抑制剂贝那普利进行干预,研究盐酸贝那普利对心肌纤维化作用和左室心肌TNF-α表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

16只SHR,雄性(北京维通利华实验动物有限公司),随机分为实验组(SHR-con组,n=8)和药物干预组(SHR-ben组,n=8)两组;同周龄WKY大鼠作实验对照组(WKY组,n=7)。适应性饲养1周后,SHR-ben组大鼠给予贝那普利(10 mg•kg-1•d-1)(北京诺华制药有限公司)灌胃,每日1次,其他两组用相当容量蒸馏水灌胃,每日1次。饲养过程中SHR-con组和SHR-ben组各死亡1只大鼠。

1.2 检测指标

1.2.1 血压测定及采血

3组大鼠喂养12周后测量体重,乌拉坦1 g•kg-1腹腔内注射麻醉,颈动脉插管,待血压稳定后BL-420生物机能实验系统检测颈动脉收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP),测3次,取其均值作为该样本的血压。之后进行腹主动脉采血,试管内含有15 μl EDTA试管,离心后取血浆1 ml,加入10 μl抑肽酶,摇匀,-20 ℃保存待测TNF-α。

1.2.2 HE染色

动物处死后留取左室心肌标本2~3 mm厚,用LEICA CM1900冰冻切片机作冰冻切片(厚度15~20 μm)。取出冰冻切片,复温,置于0.01 mol•L-1枸橼酸内15 min;浸入苏木素染液,1%盐酸酒精分化,入伊红染液;梯度酒精脱水、二甲苯透明;中性树胶封片。

1.2.3 大鼠胶原的定性和半定量分析 取左室心肌组织常规10%缓冲中性甲醛固定、包埋、切片,苦味酸-天狼猩红染色法使胶原特殊染色,心肌细胞呈黄色,胶原呈红色。采用Nikon E600POL偏振光显微镜-Pixerra Penguin 150ES CCD-Image Pro Plus5.5图像分析系统,使用Brilla等[2]描述的方法测量心肌切片的胶原容积分数(CVF)和心肌小动脉周围胶原面积与小动脉管腔面积比(PVCA/LA),用偏光显微镜观察,黄、红色为Ⅰ型胶原,绿色为Ⅲ型胶原,计算Ⅰ/Ⅲ型胶原之值。计算方法:CVF=胶原面积/(心肌面积+胶原面积),其中胶原面积不包括血管周围胶原面积。

1.2.4 血浆TNF-α测定 利用均相竞争抑制原理,采取非饱和法测定,使用FT-630G微机多探头放免仪(北京核仪器厂),数据联机处理由电脑自动处理得出结果。

1.2.5 冰冻切片观察心肌组织TNF-α表达(免疫组化SP法)

冰冻切片制作同前,取出冰冻切片复温同前。3 ml H2O2加10 μl曲拉通X100加PBS,10 min,PBS洗3次,每次3 min;封闭(驴血清):室温10 min,倾去;一抗(购于天津灏洋生物)4 ℃过夜;生物素二抗(驴抗山羊);过氧化物酶标记链酶亲和素37 ℃ 40 min,其中多次用0.1 mol PBS洗;DAB显色,苏木素复染,分化,蓝化后切片经梯度酒精脱水干燥,中性树胶封固。MOTIC-病理自动图像分析系统分析免疫组化数据,计算心肌TNF-α表达的积分光密度值(OD)。

1.3 统计学处理

用Excel建库,使用SSPS 13.0统计软件程序处理,各组数据之间显著性用多个样本均数比较及两两比较的Student-Newman-Keuls AVOVA方差分析检验,P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喂养12周后3组大鼠SBP、DBP比较

SHR-con组不论是SBP还是DBP均明显升高,而SHR-ben组SBP和DBP明显降低,见表1。

表1 各组间SBP、DBP比较

组 别nSBP/mmHgDBP/mmHg

SHR-ben组7143±14a111±11a

SHR-con组7200±24b137±13b

WKY组7129±2098±12

F值18.90512.557

P值0.0000.000

与SHR-con组比较,SBP、DBP均降低,aP<0.01;与WKY组比较,SBP、DBP均升高,bP<0.01

2.2 3组大鼠CVF、PVCA/LA、Ⅰ/Ⅲ型胶原之值的比较

SHR-con组CVF、PVCA/LA和Ⅰ/Ⅲ型胶原之值较WKY组显著上升(P<0.01),而SHR-ben组与SHR-con组相比,CVF、PVCA/LA和Ⅰ/Ⅲ型胶原之值下降。见表2。

表2 各组间CVF、PVCA/LA、Ⅰ/Ⅲ型胶原之值的比较

组 别nCVFPVCA/LAⅠ/Ⅲ型胶原之值

SHR-ben组71.76±0.48ab0.50±0.24b15.9±2.69c

SHR-con组72.69±0.59d0.98±0.33d20.8±6.08d

WKY组71.08±0.470.30±0.1113.8±2.38

F值11.4849.3744.815

P值0.0000.0000.000

与WKY组比较,CVF、PVCA/LA、Ⅰ/Ⅲ型胶原之值各指标增高,aP<0.05, d P<0.01;与SHR-con组比较,CVF、PVCA/LA、Ⅰ/Ⅲ型胶原之值均降低,bP<0.01,c P<0.05

2.3 3组大鼠血浆TNF-α浓度与左室心肌组织TNF-α的表达

SHR-con组大鼠左心室心肌组织TNF-α表达与WKY组相比明显上调(P<0.01);SHR-ben组与SHR-con组相比,TNF-α表达显著下降(P<0.01);3组大鼠血浆TNF-α浓度无明显差异。见表3。

表3 各组间血浆TNF-α与左心室心肌组织TNF-α的表达

组 别n血浆TNF-α/

fmol•ml-1组织TNF-α的

表达(OD)

SHR-ben组715.5±2.22.43±0.26ab

SHR-con组716.5±2.52.85±0.21a

WKY组714.5±1.72.06±0.11

F值0.97915.910

P值0.4190.000

与WKY组比较,心肌组织TNF-α表达增多,aP<0.01;与SHR-con组比较,心肌组织TNF-α的表达明显减少,bP<0.01

2.4 心肌组织病理形态学观察

2.4.1 冰冻切片HE染色

WKY组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,胞浆染色均匀;SHR-con组心肌细胞肥大,细胞核增大,胞浆染色加深,部分心肌肌丝排列紊乱、断裂;SHR-ben组相对改善。见图1~3。

2.4.2 光镜和偏光镜观察心肌小动脉周围胶原及心肌间质胶原 为同一视野分别用光镜(a)和偏光镜(b)观察心肌间质胶原纤维,普通光学显微镜下见到胶原呈鲜红色,偏振光显微镜下见到Ⅰ型胶原呈红色、黄色,Ⅲ型胶原呈绿色。SHR胶原主要以Ⅰ型胶原为主。SHR-con组心肌肌间隙中胶原增多,将心肌分割成条纹状,分散于心肌细胞间质;WKY组心肌间隙中有少量胶原占据;SHR-ben组心肌间质胶原纤维减少,但是多于WKY组。见图4~6。

图5 SHR-con组光镜和偏光镜观察心肌小动脉周围胶原及心肌间质胶原 天狼猩红苦味酸染色×200

图6 WKY组光镜和偏光镜观察心肌小动脉周围胶原及心肌间质胶原 天狼猩红苦味酸染色×200

2.4.3 左室心肌组织TNF-α表达 SHR-con组左室心肌组织TNF-α呈强阳性表达,表达在胞浆。SHR-ben组TNF-α表达较少。见图7~9。

3 讨论

在高血压病进程中,心肌纤维化主要表现为胶原沉积增多、各型胶原纤维比例失调(Ⅰ/Ⅲ型增加)和排列紊乱,而且以Ⅰ型胶原升高为主,Ⅰ/Ⅲ型胶原之值升高,对心功能产生不良影响,主要是增加心肌僵硬度,导致顺应性降低和舒张充盈下降;心肌小动脉周围胶原纤维增加,心肌间质纤维化,影响心脏的舒张及收缩功能[3]。

越来越多的研究结果均证实,压力负荷增加使TNF-α表达随之增加,可促使心肌肥厚,间质纤维化进一步发展。TNF-α又可引起细胞外基质如胶原及胶原纤维连接酶的表达,促进心肌细胞间质的合成作用,参与和促进心肌肥厚的过程。Marina等[4]发现6个月SHR左心室TNF-α分泌量约为血压正常大鼠两倍,在SHR稳定性高血压(3～4个月)相对早期阶段TNF-α表达增加,高血压及心脏重塑与心肌TNF-α升高密切相关。Sherif等[5]研究发现压力负荷可以造成TNF-α分泌,长时间TNF-α刺激可导致心肌纤维化和肥厚。Sun等[6]研究发现压力超负荷能升高细胞凋亡水平,加重炎症损害,产生促生长因子而增加TNF-α表达。孙联平等[7]研究丹参可预防和逆转左室肥厚,其机制不是通过降低动脉压,而是与降低心肌TNF-α表达有关。

SHR是与人类原发性高血压遗传背景最接近的模型,可自发性地使血压升高,于6周龄时血压开始升高,至10周龄时左室肥厚和心肌纤维化已经建立,并且随着鼠龄的增加而逐渐加重[8]。大量动物实验研究表明喹那普利[9]、雷米普利[10]、群多普利[11]都能减轻高血压的胶原沉积,Ⅰ、Ⅲ型胶原总量和总的CVF。丹参[12]能显著减少心肌间质、心肌血管周围的胶原总量和Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,且Ⅰ型胶原减少更明显,Ⅰ/Ⅲ型胶原之值降低,使心肌细胞间质和冠状动脉周围纤维化减轻。本研究应用贝那普利,结果显示:SHR-con组SHR SBP、DBP、CVF、PVCA/LA、Ⅰ/Ⅲ型胶原之值较WKY组显著上升(P<0.05),心肌组织TNF-α表达明显增强(P<0.01)。SHR-ben组与SHR-con组相比,各项指标均显著降低,心肌TNF-α表达下调。说明贝那普利能显著减少心肌间质和心肌血管周围的胶原,且Ⅰ型胶原减少更明显,Ⅰ/Ⅲ型胶原之值降低,使心肌细胞间质和小动脉周围纤维化减轻。因此,贝那普利可预防和逆转心肌纤维化,其机制可能是除通过降低动脉压外,还与降低心肌TNF-α表达有关。

致谢 天津武警医学院心脏病研究所给予无私帮助,提供偏振光显微镜使用,得到李玉明院长、周欣博士的指教,在此忠心感谢!

[参考文献]

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[12] 唐忠志,唐瑛,郑智,等.丹参对自发性高血压大鼠心肌I和Ⅲ型胶原的影响[J].中华临床医药,2002,3(8):10-11.

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