叶绿素显示液对小鼠直肠淋巴结染色的实验研究
[摘要] 目的：研究叶绿素显示液(CDS)对小鼠直肠淋巴结的染色作用，为其在医学科研和临床中的推广应用提供实验依据和理论参考。方法：24只成年鼠随机分为LD1组和LD2组。LD2组小鼠直肠壁内注入叶绿素显示液(CDS)。两组皆清点直肠各级淋巴结个数，LD1组取正常淋巴结，LD2组取显色淋巴结，石蜡切片，光、电镜观察。结果：于直肠壁内注射CDS，淋巴结染色迅速，不易沉淀，各级哨兵淋巴结(SLN)在30 min内被染成翠绿色,与周围组织对比明显；LD2组平均每鼠检出淋巴结6.92个，显著高于LD1组（P<0.01）；染色淋巴结24 h后仍无褪色,且染色后细胞超微结构无明显改变；术中和术后均未发现不良反应和并发症。结论：①CDS是一种优良的淋巴显色剂，染色迅速，不易沉淀，显色淋巴结与周围组织对比明显，染色持久, 且染色后淋巴结细胞超微结构无明显改变，术中和术后无不良反应发生。②LD2组CDS注射后平均每只小鼠观测到淋巴结数目显著高于LD1组，提示CDS在直肠癌根治术中可染色淋巴结，指导淋巴结清扫。
[关键词] 小鼠；叶绿素显示液；淋巴结染色
[中图分类号] R322.2+5[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2008）07（c）-017-03
The experimental study on chlorophyll disclosing solution staining lymphonodi of mice
WANG Qing1,WANG Xin-ming1，LI Xiao-dong2
(1.Department of Anatomy,Weifang Medical College,Weifang261042,China; 2.Weifang Maternal and Child Health Care Hospital,Weifang261011,China)
[Abstract] Objective: To study the effect of chlorophyll disclosing solution(CDS) staining lymphonodi rectales of mice, in order to provide reference of experiment and theory in scientific research and clinical study in the future.Methods:Twenty-four mice were divided into LD1 and LD2 group randomly. CDS was injected into rectal wall of the mice in LD2. The number of lymphonodi rectales was counted in two groups. We collected lymph nodes of rectal in group LD1. And then we took out of the stainning lymph nodes in LD2, the hematoxylineosin was performed.Results:By chlorophyll disclosing solution coloring lymph nodes, we found, by injecting the solution into rectal wall of mouse, it colored lymph nodes quickly(in 30 minutes) and was not easy to precipitate. The dyeing lymph nodes showed emerald green, it contrasted sharply with surrounding tissues and no color fading after injected 24 hours. The average number of lymph nodes observed in each mouse was 6.92, which was more than that of LD1 group significantly(P<0.01). No adverse reaction or complication were observed in the course of injection and after injection, And the ultrastructure of the lymph nodes colored at different interval was no significant difference to the ones uncolored.Conclusion:The chlorophyll disclosing solution is an ideal dye for staining lymph nodes, which colores them quickly and not easily to precipitate, and the dyeing lymph nodes contrasted sharply with surrounding tissues, and no toxic symptoms or complication is observed after staining, the ultrastructure of the lymph nodes colored at different interval is no significant difference to the ones uncolored. As shows that the chlorophyll disclosing solution can stain lymph system and guide clearance of lymph nodes in radical resection of rectal carcinoma.
[Key words] Mice; Chlorophyll disclosing solution; Staining lymphonodi
CDS在一些恶性肿瘤淋巴结清除术中作为淋巴染色剂。王新明等[1]经狗睾丸实质或子宫角内注射CDS后，进行淋巴结数目清点，淋巴结细胞显微结构观察和血中CHL浓度变化的测定，认为CDS是良好的淋巴结显色剂。Wang等[2]将准备行根治术的23位宫颈癌患者与20位子宫内膜癌患者随机分为2组，实验组于术前5 d宫颈注射CDS溶液作为淋巴染色剂，行淋巴结清扫。结果显示，染色组手术时间与对照组相比显著缩短（P<0.01）,而平均淋巴结清除数多于对照组（P<0.01），且注射CDS后患者无任何不良反应。本实验探讨叶绿素显示液对小鼠直肠淋巴结显色方面的作用，为直肠肿瘤治疗切除淋巴结提供一定的依据。
1 材料与方法
1.1 动物分组及处理
雄性昆明种小鼠24只(24~25周)，体重（49.5±2.8） g，由潍坊医学院实验动物中心提供。按窝别配成12对，随机进入空白对照组（LD1组）和淋巴结染色组（LD2组）。LD2组于直肠上段壶腹部刺入肠壁内，缓慢注入0.02 ml CDS（15 s左右注射完），见肠壁鼓起一个深绿色的小包为注射成功，同一水平选取2个注射点，观察染色情况，10 min后打开盆腔寻找并清点直肠壁着色淋巴结及肠外三级淋巴结；整个过程在20 min内完成。1、2、4、24 h各脱臼处死3只小鼠，解剖观察记录淋巴结染色情况，取着色的髂动脉间淋巴结，以0.01 mol/L PBS冲洗，分别固定于10%缓冲中性福尔马林液和2%戊二醛固定液，以制备石蜡切片和电镜切片。LD1组小鼠寻找直肠壶腹部淋巴结及直肠外的三站淋巴结,计数，摘取淋巴结，以0.01 mol/L PBS冲洗，固定，石蜡切片和电镜切片。
1.2石蜡切片、超薄切片制备
常规石蜡包埋，制厚4 μm切片，每隔40 μm取一片切片，苏木素-伊红染色，光镜下观察淋巴结。显色淋巴结经固定、脱水后用1∶9 Epon810环氧树脂包埋成块，钻石刀超薄切片，电子染色，H－7500型透射电子显微镜观察并拍片。
2 结果
2.1淋巴结的显色时间
经小鼠直肠壁内注射CDS后，注射点附近淋巴管及肠壁淋巴结立即显色(5 min内)，并迅速向远处蔓延，其余各站淋巴结均在短时间内（<30 min）显色，腹股沟淋巴结无染色。染色的淋巴结呈翠绿色或深绿色，与周围血管、神经及其他组织结构的色泽对比明显，易于识别，显色持续时间长，注射后48 h显色淋巴结仍未褪色。术中或术后均未发现不良反应或并发症。
2.2 观察到淋巴结的数目
LD1组小鼠共发现淋巴结57个，平均每只小鼠(4.75±0.87)个； CDS注射后LD2组小鼠共发现淋巴结83个，平均每只小鼠观测到淋巴结(6.92±1.00)个，显著高于LD1组（P<0.01）。
2.3淋巴结切片的光镜观察
染色淋巴结切片行苏木素-伊红染色，光镜下观察到，1 h时，在皮质的被膜下窦和小梁周窦发现大量的叶绿素颗粒，而髓窦和输出淋巴管内并未发现叶绿素颗粒；4 h后，淋巴结皮质，髓质内可观察到叶绿素颗粒，叶绿素颗粒呈浅褐色，与淋巴液及淋巴细胞相混合(图1)。LD1组小鼠淋巴结无叶绿素颗粒。光镜下显色淋巴结的形态结构未发生异常变化。
2.4淋巴结切片的电镜观察
LD1组小鼠显示正常的淋巴结超微结构，皮、髓质内各组成成份无病理变化，无叶绿素颗粒。LD2组小鼠注射CDS后不同时间，显色淋巴结超薄切片的电镜观察结果显示，叶绿素颗粒在其内的分布和含量有差异，其中注射后4 h时淋巴结内叶绿素颗粒密度最高，但细胞超微结构无明显改变：注射CDS后1.0 h见皮质内有叶绿素颗粒，颗粒呈指纹状，位于巨噬细胞内，髓窦内亦可见叶绿素颗粒（图2）。注射后4.0 h皮质内可见巨噬细胞内含大量叶绿素颗粒；髓质细胞内发现叶绿素颗粒分布较多（图3）。注射CDS后24.0 h，皮质内可见叶绿素颗粒分布；髓质细胞内亦发现深染的叶绿素颗粒。
3 讨论
叶绿素显示液（CDS）可单独显示淋巴管、淋巴结，无毒性作用，染色淋巴结与周围组织对比明显。术中注射CDS，临床医生在手术时，可在直视下根据绿染的淋巴结、淋巴链及淋巴管进行系统清除，凭借颜色的差异，可防止损伤血管和神经，避免钳夹淋巴结，有利于防止肿瘤医源性扩散[3]。解家英等[4-7]研究报道，妇科恶性肿瘤病人宫颈注射CDS时和注射后，患者无不良反应及并发症。研究组淋巴结切除率明显高于对照组，切除淋巴结的时间短于对照组，其实验也表明CDS是一种理想的淋巴染色剂。1997年1月~2000年3月，仇沂洲等[8]对50例喉癌、下咽癌患者研究发现，颈淋巴结被染成深绿色，与周围组织颜色对比明显，便于颈部手术和采集淋巴结，经病理检查证实，颈淋巴结的转移率为48%。证实CDS染色清晰，安全无毒，便于手术，可以在颈淋巴结清除术中常规应用。
本实验发现，经小鼠直肠浆膜下注射CDS后，染色淋巴结切片行苏木素-伊红染色，光镜下观察，1 h时，在皮质的被膜下窦和小梁周窦发现大量的叶绿素颗粒；而髓窦和输出淋巴管内并未发现；4 h后，淋巴结髓质内可观察到叶绿素颗粒。这说明叶绿素颗粒是经输入淋巴管进入淋巴结的。叶绿素颗粒呈浅褐色，与淋巴细胞相混合。未注射CDS组小鼠淋巴结切片显示出正常的淋巴结组织结构，淋巴结内无叶绿素颗粒。光镜下显色淋巴结的形态结构未发生异常变化。
我们将显色淋巴结取材，经固定、脱水后用树脂包埋成块，使用超薄切片机进行超薄切片，经电子染色后用透射电镜观察叶绿素颗粒所在部位及淋巴结各种亚细胞的超微结构。看经过染色后不同时间内叶绿素颗粒出现在哪些部位及淋巴结超微结构是否发生变化以证实CDS是否具有毒性作用。实验显示染色淋巴结的超薄切片上，注射CDS后，叶绿素颗粒多位于巨噬细胞内，髓窦内亦可见叶绿素颗粒。注射后4.0 h巨噬细胞内含大量叶绿素颗粒；注射CDS 24 h后,皮质、髓质内叶绿素颗粒变少。该实验还发现，注射CDS后的不同时间间隔内，染色淋巴结内细胞超微结构形态无明显改变，这就证实了CDS无急性毒副作用。
[参考文献]
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（收稿日期：2008-03-07）
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