应用小鼠灌胃针和点样吸头建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法

材料与方法

1.1 实验材料

动物：10只Wistar大鼠[体重220～250 g，许可证号：SCXK （京） 2012-0001]和10只雄性CB17-SCID小鼠[体重24～28 g，许可证号：SCXK （京） 2012-0001]购于北京维通利华动物实验动物技术有限公司，常规饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物房内，12 h/12 h昼夜光照，动物房温度为22～24℃，湿度为70%。

材料：乙醚（国药集团化学试剂有限公司）、小鼠灌胃针（12#，6 cm）、1～200 μl Pipette Tip （Thermo Fisher，Cat.# 010-Q）、PBS（Ca2+，Mg2+ Free，Hyclone，GE）、血细胞计数板、1#手术线、Leica AM6000显微镜、1640培养基、四季青胎牛血清及1 ml和10 ml无菌注射器（镇江康利医疗器械有限公司）。

1.2 操作方法

1.2.1 大鼠肺泡灌洗操作方法 实验准备：首先对小鼠灌胃针等器具进行灭菌。在50 ml离心管底部填充约5 ml体积的棉球，然后用吸管向棉球内部添加3 ml乙醚液体，如果需要增加大鼠麻醉数量，适时补充乙醚的使用剂量。对Wistar大鼠进行麻醉处理，观察大鼠的呼吸频率，待呼吸由急促转慢时，将其固定于鼠板上，此时如果大鼠苏醒，重复进行麻醉。将大鼠处死（大鼠腹主动脉法采血），然后喷洒适量75%乙醇，在无菌条件下进行支气管肺泡灌洗术。

肺泡灌洗操作：①沿正中线剪开腹部和颈部皮肤，分离大鼠肺和气管组织。将气管和肺组织置于直径100 mm培养皿中，先将1#手术线打结放在距离气管切口端5 mm左右位置，然后将经过灭菌处理的小鼠灌胃针插入到大鼠气管中，同时用力系紧之前在近气管切口端的打结（图1）。取注射器抽取预冷的不含钙镁离子的PBS缓冲液5 ml注入肺腔，轻轻按摩肺脏，停留20 s后再缓慢回抽支气管肺泡灌洗液。以上操作重复10次，25～40 ml液体。② 置于4℃离心机以1000 r/min，离心10 min，后弃上清液。③ 10%小牛血清的RPMI1640细胞培养液悬浮细胞，经过培养后，贴壁生长的大鼠肺泡巨噬细胞可以进行下一步的实验研究。

1.2.2 小鼠肺泡灌洗操作方法 实验准备：首先进行插管器具处理，即用剪刀减掉吸头末端约5 mm，在实验操作之前完成Thermo吸头与1 ml注射器的吻合要求，注意一定要吻合良好（如果剪刀剪去的长度不合适，会使吸头与注射器的吻合性差，灌洗时发生漏液）。处理好吸头后，与其他实验器具一并灭菌。CB17-SCID鼠处死（小鼠摘眼球法采集外周血），固定鼠板后喷洒适量75%乙醇，在无菌条件下进行支气管肺泡灌洗术。

肺泡灌洗操作：①沿正中线剪开腹部和颈部皮肤，分离小鼠肺和气管组织。将气管和肺组织置于直径60 mm培养皿中，先将1#手术线打结放在在气管切口端5 mm左右位置，然后将经过剪切及灭菌处理的吸头插入到小鼠气管中，同时用力系紧之前在近气管切口端的打结（图2）。取注射器抽取预冷的不含钙镁离子的PBS缓冲液1 ml注入肺腔，轻轻按摩肺脏，停留20 s后再缓慢回抽支气管肺泡灌洗液。以上操作重复10次，5～8 ml液体。②置于4℃离心机以1000 r/min，离心10 min，后弃上清液。③10%小牛血清的RPMI1640细胞培养液悬浮细胞，经过培养后，贴壁生长的小鼠肺泡巨噬细胞可以进行下一步的实验研究。

2结果

依靠小鼠灌胃针和电泳点样吸头建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法共完成20次插管和肺泡灌洗操作，收集的肺泡巨噬细胞，用10%小牛血清的RPMI1640细胞培养，经过细胞计数可以得到约1×107个大鼠肺泡巨噬细胞，细胞形态特征如图3所示； 经过计数可以得到约3×106个小鼠肺泡巨噬细胞，形态特征如图4所示。经过贴壁选择及图像采集证明获得的细胞为高质量的肺泡巨噬细胞，提示实验技术方法有效，创新收集肺泡灌洗液的方法成功。

3討论

近年呼吸系统疾病的研究呈上升趋势，支气管肺泡灌洗技术已越来越多地应用于外源性化合物对肺脏毒性作用的研究，通过对支气管肺泡灌洗液（ bronchalveolar lavage fluid， BALF）中细胞、生化、肺表面活性物质等多种成分的分析，可以探讨化合物对肺脏的作用机制[10-12]。BALF中一些酶类的变化可以直接反映肺组织细胞的氧化损伤情况。获取的肺泡巨噬细胞直接暴露于引发呼吸系统炎性疾病的各种因子中，而这些成分激活的肺泡巨噬细胞能够分泌多种细胞因子和趋化因子并激活其他效应细胞，甚至破坏肺部组织结构[13-14，2]。应用常规实验室耗材建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法已经成为呼吸系统损伤机制研究的必要技术。

应用常规实验室耗材建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法具有以下优点：①将气管和肺组织剪切下来，可视性更好，可以更加直观地完成灌洗操作；②应用小鼠灌胃针完成大鼠肺泡灌洗操作，首先，可以更好地避免实验器具给组织带来的损伤，另外，还可以防止结扎后组织和灌胃针脱离的发生；③应用处理后于1 ml注射器相吻合的点样吸头，由于吸头一端到另一端逐渐变细，所以可以与小鼠气管接触得更紧密，防止漏液的发生，同时也可以避免使用金属锐器完成灌洗造成的组织破坏。

操作的注意事项：①灌洗前采集血样时，大鼠腹主动脉采血量应>6 ml；小鼠摘眼球采血量应>0.5 ml；如果采集的血量太少，则需要加入适量的红细胞裂解液，消除红细胞对研究带来的影响；按照上述要求完成的肺泡灌洗液收集的细胞经过培养后，经过更换培养基，即可以除去未贴壁生长的红细胞。②分离大、小鼠气管和肺组织时，切勿剪破肺组织，造成灌洗操作无法完成，而且小鼠气管的剪切要尽量靠近其口咽部，保证气管长度足够通过吸头完成肺泡灌洗液的收集。③进行灌洗时，注意灌胃针和吸头的推进角度及注射器推入液体的速度，推进角度太大容易造成气管组织破损，液体推入的速度太快容易漏液。④抽取灌洗液时，要由气管一端到另一端变换位置完成，一般来说，可以由近支气管端向远端进行，因为气管有1/3左右的纤维结缔组织的特殊组织结构，所以抽取液体时结缔组织会阻塞吸头，需要变更位置完成。⑤进行肺泡灌洗操作时，要逐一完成，如同时收集多组气管和肺组织，可由多人完成肺泡灌洗液操作，否则会影响获得肺泡巨噬细胞的质量。

综上所述，通过小鼠灌胃针和电泳点样吸头建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法，大胆地改进和创新了肺泡灌洗方法的实验操作，应用常规实验室耗材建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法操作简洁，可重复性好，能够广泛用于大、小鼠肺泡灌洗液的收集。熟练此种技术可以更好地为科学研究服务。

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