PA对人胃癌细胞放射敏感性的分析

材料与方法

1.1试剂和仪器

RPMI 1640、胰酶、96/6 孔培养板购自Cellgro公司；CO2细胞培养箱、酶标仪购自Sanyo公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自Sigma公司。

1.2细胞培养

人胃癌细胞株SGC7901（上海研成生物科技有限公司），细胞在RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。2～3 d换液1次，细胞贴壁生长良好。

1.3方法

1.3.1照射方法 使用西门子PRIMUS-M型直线加速器进行照射。培养板下放置1 cm标准等效填充物（有机玻璃板），采用源轴距照射（等中心照射），剂量率2 Gy/min，照射面积10 cm×10 cm，源靶距100 cm[6]。

1.3.2 MTT法 采用MTT法获得PA对SGC7901细胞的半数抑制浓度（IC50）。按每孔5×103个/ml细胞均匀接种于96孔培养板，细胞贴壁后，更换不同浓度PA（5、10、20、40、80 μg/ml）分别加入各孔内，同时设空白组作对照，仅加入等量的培养液，不接种细胞。培养24 h后，弃去培养液，每孔加入MTT溶液10 μl，4 h后终止培养，离心后弃上清，加入DMSO溶解沉淀，490 nm波长测量吸光值（A），计算细胞抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（空白组A值-加药组A值）/空白组A值×100%。实验重复3次，取平均值得出IC50[7-8]。

1.3.3克隆形成实验 取SGC7901细胞，消化接种成单细胞悬液，接种合适数量的细胞于6孔板中。实验分为单纯照射组和PA+照射组，两组都给予0、2、4、6和8 Gy的X线照射，设置3个复孔。结晶紫染色，计算>50个细胞的克隆数。

1.3.4细胞周期检测 SGC7901细胞接种于6孔板中，浓度为1×106个/ml，培养24 h，分为空白对照组、单纯照射组、PA+照射组，以1000 r/min离心去除固定液，调整细胞加入碘化丙啶（PI）染液[9-10]，上机检测并分析细胞周期分布。

1.3.5细胞光镜形态学观察 设空白对照组、单纯照射组、PA+照射组，配制0.15%的胰蛋白酶消化细胞，制成5×104个/ml单细胞悬液接种于24孔培养板中[11]，置于培养箱内培养48 h后，PBS洗涤，室温干燥后树胶封片，光镜下观察、拍照。

1.4统计学处理

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 PA对胃癌SGC7901细胞IC50的统计

PA对胃癌SGC7901细胞的IC50为16.11 μg/ml，故选择IC50的20%即接近无毒药物浓度为3.21 μg/ml，用于克隆形成实验，作为放射增敏浓度。

2.2 PA对胃癌SGC7901细胞放射敏感性的影响

随着照射剂量的逐渐增加，单纯照射组和PA+照射组细胞存活率呈下降趋势，从4 Gy开始，PA+照射组细胞的存活率低于单纯照射组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.3 PA对胃癌SGC7901细胞周期分布的影响

与空白对照组比较，单纯照射组、PA+照射组的G2/M期细胞比例上升，但S期细胞比例下降，差异有统计学意义（P<0.05）。G0/G1期略有升高，但差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.4光镜观察下的细胞形态学结果

光镜下观察SGC7901细胞排列分散，为多角形，SGC7901细胞界限清楚，细胞核圆形，体积大。PA+照射组细胞界限不清，细胞变圆，核仁着色浅，胞质内可见大量颗粒（图1）。

3讨论

恶性肿瘤对人类健康有严重威胁，放射治疗在肿瘤的治疗中具有重要作用。因为肿瘤本身存在的敏感性和乏氧程度等的不同，所以肿瘤对放射治疗敏感性有差异[12-13]。胃癌患者大多数对放射治疗的耐受性较差，因此使用良好的放射增敏剂是提高胃癌放疗效果的有效方法[14-15]。

PA抗癌机制主要是结合于细胞骨架的微管蛋白，促进微管蛋白的聚集，阻滞其解聚成亚单位，抑制有丝分裂的进行，进而诱导细胞凋亡[16-18]。实验证明PA具有放射增敏作用，可能是中止对放疗敏感的G2和M期[19]。

本研究中克隆形成实验结果显示，随着X射线照射剂量的增加，胃癌细胞的集落形成下降，同等剂量下，PA+照射组与单纯照射组比较，集落形成数量下降。自4 Gy照射剂量开始，单纯照射组和PA+照射组细胞的存活率比较差异显著，提示PA具有放射增敏作用。

放射生物学研究指出在细胞周期的不同时期放射的敏感性也不同，放疗最敏感为M期和G2期细胞，其次是G0/G1期，可通过使进入S期的细胞减少和造成G2/M期阻滞进而改变细胞周期，杀伤肿瘤细胞。在本研究中，PA+照射组G2/M期比例升高，S期比例下降，与单纯照射组比较，差异显著，提示PA对于胃癌细胞的增敏影响可能通过增加对放射线敏感的G2/M期分布比例来实现，与相关文献报道[20]相吻合。

综上所述，PA对胃癌SGC7901细胞具有放射增敏作用，其机制可能是G2/M期阻滞。本研究为PA的综合治疗胃癌提供了一定的理论依据。

[参考文献]

[1]所剑，王大广，刘泽锋.早期胃癌诊断和治疗[J].中国实用外科杂志，2011，8（31）：717-718.

[2]陈颜，官成浓.TLR4与肿瘤的研究进展[J].临床医学工程，2012，19（1）：138-140.

[3]郑秀龙，金一尊，沈瑜.肿瘤治疗增敏药[M].上海：科学技术文献出版社，2002：163-164.

[4] Chen P，Zhao SH，Chu YL，et al.Anticancer activity of PDSS2，prenyl diphosphate synthase，subunit 2，in gastric cancer tissue and the SGC7901 cell line[J].Anticancer Drugs，2009，20（2）：141-148.

[5]Kurt M，Aksoy S，Cizginer S，et al.Gastric cancer and the coincidental finding of herpetic esophagitis immediately after pregnancy：a case report[J].J Reprod Med，2007，52（5）：425-427.

[6]Chen W，Feng L，Nie H，et al. Andrographolide induces auto-phagic cell death in human liver cancer cells through cyclophilin D-mediated mitochondrial permeability transition pore[J].Carci-nogenesis，2012，33（11）：2190 -2198.

[7]王立威，刘丽萍，吴宣萱.洛铂与放疗联合治疗对BGC823胃癌细胞凋亡的影响[J].中国老年学杂志，2012，32（10）：2094-2095.

[8]Jendrossek V.The intrinsic apoptosis pathways as a target in anticancer therapy[J].Curr Pharm Biotechnol，2012，13（8）：1426-1438.

[9]仇晓军，陆德炎，季斌，等.放射诱导胃癌细胞的凋亡及其相关基因的研究[J].中华放射肿瘤学杂志，2005，14（5）：447-450.

[10]赵姗，杨光磊，吕英谦，等.洛铂对肺癌A549细胞作用的初步探讨[J].临床肿瘤学杂志，2011，16（1）：14-18.

[11]徐志渊，李德锐，林英城，等.人鼻咽癌耐顺铂细胞系的放射增敏实验[J].中华肿瘤放射与防治杂志，2009，16（19）：1470-1473.

[12]夏曙，刘飞，刘细友，等.COX-2抑制剂塞来昔布提高人结肠癌细胞SW480的放射敏感性[J].世界华人消化杂志，2010，18（19）：1990-1994.

[13]Mutter R，Lu B，Carbone P，et al.A PhaseⅡstudy of celecoxib in combination with paclitaxel，carboplatin，and radiotherapy for patients with inoperable stageⅢA/B non small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15（6）：2158-2165.

[14]Che SM，Zhang XZ，Hou L，et al.Cyclooxygenase-2 inhibitor NS398 enhances radiosensitivity of radioresistant esophageal cancer cells by inhibiting AKT activation and inducing apoptosis[J].Cancer Invest，2010，28（7）：679-688.

[15]蒋谦，陈环球，周晓明，等.多西PA对人胃癌细胞BGC-823 hTERT启动子转录活性及其调控基因c-myc表达的研究[J].中华肿瘤防治杂志，2007，14（20）：1531-1534.

[16]张炜，崔洪尊，嵇振岭.PA对人胃癌细胞SGC-7901增殖及凋亡的影响[J].现代肿瘤医学，2008，16（11）：1870-1872.

[17]黄惠风，施瑞华，凌亭生，等.磁性纳米PA微球对人胃癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的影响[J].中国消化内镜，2007， 1（3）：39-42.

[18]荣海芳，王立国，白玉贤.拉帕替尼联合PA对人胃癌细胞NCI-N87抑制作用的实验研究[J].肿瘤学杂志，2015， 21（12）：993-998.

[19]陈曦，林振兴，林锦娟，等.Bcl-2siRNA对胃癌细胞凋亡及其PA敏感性影响研究[J].中华肿瘤防治杂志，2013， 20（20）：1580-1584.

[20]张晔，赵明芳，曲秀娟，等.β-榄香烯联合PA诱导胃癌细胞凋亡的体外研究[J].现代肿瘤医学，2013，21（5）：965-968.

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