Cd2+、Pb2+、Hg2+对膨胀肾形虫的毒性效应

摘要：研究了重金属Cd2+、Hg2+和Pb2+对膨胀肾形虫（Colpoda inflata）的毒性效应。在3种重金属离子作用下，膨胀肾形虫的生长受到明显的抑制，对膨胀肾形虫的毒性从大到小依次为Hg2+、Pb2+、Cd2+。联合毒性实验结果表明，3种重金属离子的不同配比下，联合作用类型和强度有一定的差异。Cd2+-Pb2+在浓度比1∶1和毒性比1∶1时均为拮抗作用；Pb2+-Hg2+在浓度比1∶1时为协调作用，毒性比1∶1时先表现为拮抗作用后表现为协同作用； Hg2+-Cd2+在浓度比1∶1时为协同作用，毒性比1∶1时为拮抗作用； Cd2+-Pb2+-Hg2+在浓度比1∶1∶1时均为协同作用，毒性比1∶1∶1时由拮抗作用逐渐转为协同作用。

关键词：重金属离子；膨胀肾形虫；急性毒性；联合毒性

中图分类号：X171 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1556-05

纤毛虫是由单细胞构成的完整的生命体，具有生长、呼吸、代谢、排泄等一切生命活动。纤毛虫与它们所在的环境密切接触，能对外界环境的变化做出敏捷的反应，且绝大多数纤毛虫种类为世界性分布，不受季节和地区差异的限制，因此在环境污染监测中具有不可替代的作用[1-3]。在20世纪初，水生纤毛虫就开始应用于淡水生态系统的监测中，目前水生纤毛虫作为指示生物已广泛用在淡水水环境的污染指示与评价中[4-7]，而对土壤纤毛虫重金属毒性状况的研究，尤其是重金属联合毒性的研究并不多见。

作为矿业资源枯竭型城市，黄石市正处于城市经济发展转型期，其土壤中存在的大量重金属离子严重影响该地区的生态系统，矿区土地的修复与利用已成为经济发展的瓶颈。选择广泛存在于自然环境的膨胀肾形虫为受试生物，黄石市土壤中常见的金属Cd、Pb和Hg为毒物，通过单一毒性实验得出半数抑制浓度（IC50），为更准确地评价重金属对土壤微生物的毒性提供基础数据和技术支持。在单一毒性实验的基础上，进一步研究3种金属离子对膨胀肾形虫的联合毒性效应，对重金属污染土壤的再利用、环境质量评价及生态修复提供科学依据有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 虫种及培养

实验所用的材料为肾形目膨胀肾形虫（Colpoda inflata），采自湖北理工学院后山，经实验室用Pringsheim′s 液大量培养繁殖，选取生长状态良好的个体分离后在室温下以土壤浸出液为培养液，以米粒繁殖细菌为饵料，建立克隆培养。土壤浸出液的配制是取300 g土壤加入蒸馏水1 000 mL，煮沸10 min，冷却后用纱布过滤去除沉渣，再用滤纸过滤制得[8]。CdSO4·8H2O、Pb（CH3COO）2·3H2O、HgCl2均为分析纯试剂，用蒸馏水配制成200 mg/L母液，实验时稀释成所需要的浓度。

1.2 预备实验

实验选用6孔细胞培养板，每孔中加入1.5 mL的重金属培养液，再加入0.5 mL的土壤纤毛虫母液。以10倍之差估算5个浓度梯度，处理24 h，分别找到Cd2+、Pb2+和Hg2+的100%抑制浓度和无抑制浓度。

1.3 单一金属离子毒性实验

根据预备实验结果设5个浓度组和1个对照组，同时设2个平行组，分别在24、48、72和96 h记录1 mL培养液中膨胀肾形虫的个数，重复试验2次。根据预备实验结果，各种重金属离子的正式单一毒性实验浓度：Cd2+为1.90、3.00、4.80、7.60、12.00 mg/L；Pb2+为2.40、3.80、6.00、9.50、15.00 mg/L；Hg2+为0.20、0.26、0.32、0.40、0.50 mg/L。

1.4 两种金属离子联合毒性实验

在单一毒性实验的基础上，按浓度比1∶1和毒性比1∶1进行Cd2+-Pb2+、Pb2+-Hg2+、Cd2+-Hg2+共存下的联合毒性实验。浓度比1∶1时，两种金属离子在土壤浸出液中的浓度分别为：Cd2+-Pb2+，1.30、2.00、3.20、5.00、7.90 mg/L；Pb2+-Hg2+，0.016、0.025、0.040、0.060、0.100 mg/L； Hg2+-Cd2+，0.016、0.025、0.040、0.060、0.100 mg/L；毒性比1∶1时，以48 h IC50值为一毒性单位，相应的毒性单位为0.30、0.38、0.49、0.63、0.80。

1.5 3种金属离子的联合毒性实验

按浓度比1∶1∶1和毒性比1∶1∶1进行Cd2+-Pb2+-Hg2+共存下的联合毒性实验。浓度比1∶1∶1时，Cd2+-Pb2+-Hg2+在土壤浸出液中浓度分别为0.05、0.08、0.13、0.20、0.32 mg/L；毒性比1∶1∶1时，以48 h IC50 值为一毒性单位，3种溶液的混合按照0.17、0.21、0.26、0.33、0.42倍48 h IC50值进行，相应的毒性单位为0.51、0.63、0.78、0.99、1.26。

1.6 虫体死亡率的测定

取预实验获得的8个梯度（含对照组）的药物溶液各1 mL，加入10 个虫体，实验分2 h 和12 h 两组，各设3 个平行，结果取其平均值。每隔2 h 观察1次。

1.7 半数抑制浓度（IC50）的计算方法

采用几率单位法，根据死亡百分数-几率单位换算表，将死亡百分数换算成死亡几率单位，在两者间成直线关系时，以回归法求出IC50值[9]。

1.8 联合毒性的评价方法

经实验得到单一毒性和联合毒性的IC50后，采用相加指数法（AI）来评价联合毒性。具体方法见参考文献[10]。

2 结果与分析

2.1 单一金属离子的急性毒性效应

Cd2+、Pb2+、Hg2+对膨胀肾形虫的单一急性毒性实验结果见表1。由表1可知，Cd2+、Pb2+和Hg2+对膨胀肾形虫24 h的IC50分别为11.303、6.840、0.312 mg/L；48 h的IC50分别为 8.951、6.305、0.275 mg/L；72 h的IC50分别为8.714、6.241、0.266 mg/L；96 h的IC50分别为5.196、4.365、0.262 mg/L。

2.2 两种重金属离子的联合毒性作用

两种重金属共存时，联合作用类型见表2-表4。由表2可知，Cd2+-Pb2+在浓度比1∶1和毒性比1∶1时，其AI值均小于零，为拮抗作用，表明Cd2+-Pb2+共存时相互降低了毒性作用。

由表3可知，Pb2+-Hg2+在浓度比1∶1时，其AI值均大于零，为协同作用。毒性比1∶1时， 24 h的AI值小于零，为拮抗作用，48～96 h的AI值均大于零，为协同作用。由此可见，毒性比1∶1时， Pb2+-Hg2+组合的联合毒性作用是先减弱后增强。

由表4可知，Cd2+-Hg2+在浓度比1∶1时为协同作用，相互增强了毒性作用；毒性比1∶1时为拮抗作用，相互降低了毒性作用。

2.3 3种重金属离子的联合毒性作用

3种重金属共存时，联合作用类型见表5。Cd2+-Pb2+-Hg2+在浓度比1∶1∶1时为协同作用，表明此时3种离子共存相互增强了毒性。毒性比1∶1∶1时，24和48 h的AI值小于零，为拮抗作用，72和96 h的AI值均大于零，为协同作用，表现出毒性作用先减弱后增强。

3 讨论

3.1 单一金属离子对膨胀肾形虫的急性毒性效应

在不同浓度的重金属作用下，膨胀肾形虫的生长受到明显抑制。比较3种重金属离子在相同暴露时间下的IC50值，可得出3种重金属离子对膨胀肾形虫的毒性从大到小依次为Hg2+、Pb2+、Cd2+。李娜等[11]以卤虫（Artemia salina）无节幼虫为试验材料，张青田等[12]以俄罗斯卤虫（Artemia parthenogenetica），Rehman等[13]以Euplotes mutabilis为试验材料研究了Hg2+、Pb2+、Cd2+等毒性作用，其毒性由强到弱的顺序为Hg2+、Pb2+、Cd2+，陈娜等[14]以水螅（Hydra sp.）为试验材料研究重金属离子的毒性作用，结果表明其毒性大小顺序为Hg2+、Cd2+、Pb2+，而Al-Rasheid等[15]以Euplotes mutabilis为试验材料研究重金属离子的毒性作用，结果表明其毒性大小顺序为Pb2+、Cd2+、Hg2+，说明金属离子对生物体的毒性大小因物种而异。但总体上Hg2+的毒性比其他离子要大。3种重金属离子IC50值随作用时间的延长而变小，具有明显的时间-效应关系，这表明随着作用时间延长，膨胀肾形虫对重金属离子的耐受性降低，这可能与重金属离子在生物体内的积累有关。

3.2 金属离子对膨胀肾形虫的的联合毒性效应

污染物的联合毒性作用是一个复杂的问题，对于联合作用的机理尚不明了，特别是对3种以上金属离子的联合毒性研究并不多见。Cd是生物体非必需元素，它使某些活性传递机制受阻，酶失活以及内分泌系统受影响，并引起DNA单链断裂，损害DNA修复系统，从而导致细胞凋亡[9，16]。Pb对生物体也有较强的毒性，能降低SOD的活性，从而导致氧自由基蓄积，引起生物膜脂质过氧化作用而造成机体损害[9，17]。低浓度的Pb2+对酶有激活作用，高浓度则有抑制作用，而且是慢性毒性作用[18]。Hg 对于生物体一般都是剧毒的，Hg 的毒性很可能起因于它对巯基具有极大的亲和作用，从而导致许多蛋白质和酶的失活[16]。已有研究表明细菌Enterobacter aerogenes存在利用汞离子还原酶解毒的机制[19]，在纤毛虫体内也可能存在类似对Hg 进行解毒的机制。该机制在低浓度Hg作用下即可启动，只有当外界Hg 浓度超过其解毒能力时方产生毒害作用。

试验结果表明浓度比1∶1时，Cd2+或Pb2+对Hg2+的毒性具有协同作用，可能是低浓度的Cd2+或Pb2+与Hg2+共存于生物体时，使其细胞膜的通透性加大，从而毒性增强。毒性比1∶1时，Cd2+对Pb2+或Hg2+的毒性具有拮抗作用，这可能是由于Cd2+与Pb2+或Hg2+对进入细胞的生物活性位点竞争的结果。由于金属进入细胞的活性位点有限，当Cd2+浓度远大于Pb2+或Hg2+浓度时，这些进入细胞的活性位点大部分被Cd2+所占据，使毒性较大的Pb2+或Hg2+无法进入细胞。浓度比1∶1时Cd2+或Pb2+对Hg2+的毒性作用与毒性比1∶1时的作用结果不同，说明联合作用效应还与混合物的浓度及各组分的配比有关。实验结果与陈娜等[14]、隋国斌等[20]、王银秋等[21]、高晓莉等[22]的研究结果有一定的差异，可能的原因是联合作用效应不仅与污染物组成有关，也与测试生物的种类有关。

毒性比1∶1时，Pb2+-Hg2+组合24 h为拮抗作用，48～96 h转为协同作用；Cd2+-Pb2+-Hg2+组合24～48 h为拮抗作用，72～96 h为协同作用，表明污染物对膨胀肾形虫的联合毒性随暴露时间的不同而不同。修瑞琴等[23]在研究氟和硒对斑马鱼的联合毒性，陈碧娟等[24]在研究乙醛和乙二醇对草鱼幼鱼联合毒性时也发现类似的现象。至于这种先拮抗、后协同方式的作用机理尚不明确，需做进一步的研究。

不同的生物种类对同一复合污染条件下的各个污染物以及污染物之间的交互作用有不同的反应模式[25]。因此，当几种金属离子共存于环境中时会产生复杂的联合毒性效应，仅用单一毒物的含量去判断污染的毒性危害是不切实际的，生态环境的污染评价在测定单一毒物含量的同时，还应从联合毒性的角度对土壤污染做出综合评价。

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