吸烟对大鼠免疫系统功能的影响
[摘要] 目的 探讨吸烟对大鼠血清CD3、CD4、CD8 T淋巴细胞和IgA、IgG、IgM及补体含量影响的时间效应。 方法 雄性健康清洁级Wistar大鼠30只，随机分为对照组和烟草烟雾暴露组，每组15只大鼠。对照组暴露于正常饲养环境，烟草烟雾暴露组每日暴露于烟草烟雾环境30 min，每日2次。两组大鼠分别于烟草烟雾暴露时（T0）、烟草烟雾暴露1个月（T1）、烟草烟雾暴露2个月（T2）、烟草烟雾暴露3个月（T3）、烟草烟雾暴露4个月（T4）、烟草烟雾暴露5个月（T5）和烟草烟雾暴露6个月（T6）时采内眦静脉血，检测血清CD3、CD4、CD8 T淋巴细胞的含量，测定IgA、IgG、IgM、C4、C3含量。 结果 烟草烟雾暴露组CD3、CD4 T淋巴细胞自T3时逐渐下降（P < 0.05），CD8 T淋巴细胞自T4时逐渐上升（P < 0.05），对照组各指标各时点间均无明显差异。与对照组比较，烟草烟雾暴露组T3～T6时CD3和CD4 T淋巴细胞含量均明显减少（P < 0.05），CD8 T淋巴细胞含量均明显增多（P < 0.05）。T4～T6时，对照组IgG、IgM和C4含量均明显高于烟草烟雾暴露组（P < 0.05）。烟草烟雾暴露组IgG、IgM和C4、C3自T4时逐渐下降；对照组各指标各时间点间均无明显差异。 结论 烟草烟雾暴露损伤细胞免疫的时间窗为3个月。短期吸烟对体液免疫功能影响不大，长期可致体液免疫功能逐渐受损，具体机制尚需进一步研究证实。
[关键词] 吸烟；细胞免疫；体液免疫
[中图分类号] R562.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（c）-0004-04
Influence of smoking on rats" immune system function
NING Xin
Jinqiu Hospital of Liaoning Province， Liaoning Province， Shenyang 110015， China
[Abstract] Objective To explore the effect of smoking on the time effect of rats" serum CD3， CD4， CD8 T lymphocytes and IgA， IgG， IgM and complement content. Methods Thirty male healthy Wistar rats of clean grade were randomly divided into control group and tobacco smoke exposure group， with 15 rats in each group. The control group were exposed to normal feeding environment， tobacco smoke exposure group were daily exposed to environmental tobacco smoke for 30 minutes， 2 times a day. Two groups of rats were exposed to tobacco smoke （T0）， exposure to tobacco smoke for 1 month （T1）， exposure to tobacco smoke for 2 months （T2）， exposure to tobacco smoke for 3 months （T3）， exposure to tobacco smoke for 4 months （T4）， exposure to tobacco smoke for 5 months （T5） and tobacco smoke exposure for 6 months （T6） by inside canthus vein blood， them serum CD3， CD4， CD8 content of T lymphocytes and IgA， IgG， IgM， C4， C3 content were detected. Results CD3， CD4 T lymphocytes in tobacco smoke exposure group showed gradually decreased from T3 （P < 0.05）， CD8 T lymphocytes gradually increased from T4 （P < 0.05）， those in control group showed no significant difference. At T3 to T6， compared with those in the control group， CD3 and CD4 T lymphocyte content of tobacco smoke exposure group were less significantly （P < 0.05）， CD8 were more （P < 0.05）. At T4 to T6， IgG， IgM and C4 content in control group were significantly higher than those in tobacco smoke exposure group （P< 0.05）. From T4， IgG， IgM and C4， C3 in tobacco smoke exposure group showed decreased gradually； the differences of each index in control group at each time point showed no significance. Conclusion Tobacco smoke exposure time window of damage cellular immunity is 3 months. The impact of short-term smoking on humoral immune function is little， long-term can cause humoral immune function gradually damaged， the specific mechanism still needs further study to confirm.
[Key words] Smoking； Cellular immunity； Humoral immunity
吸烟是人体将烟草燃烧后的气体经过口腔吸入机体内，对机体各部位均会产生危害。研究发现，吸烟导致脑部血管痉挛出现中风现象，导致血液中的血小板黏性增高，出现冠脉血栓的形成，进一步增加心肌梗死的发病率；吸烟能引致肺部支气管上皮细胞的不规则变化及运动出现障碍，同时导致上皮细胞纤毛变短，使肺部支气管抵抗力下降，导致感染甚至发生肺癌[1]；烟草中的尼古丁及燃烧后产生的一氧化碳使骨骼的再生进度延缓，导致骨质疏松加速；烟草还可使胃、肠道、肝脏、眼及生殖系统等各器官受到不同程度的损伤。吸烟不但是一种不健康的自身生活习惯，同时也会对周围环境产生污染，吸烟时喷出的烟雾是一种非常强烈的刺激物质，这种物质可散发4000余种气体和粒子，这些气体和粒子中不但至少有40种会使机体致癌[2]，而且这些粒子在吸烟停止无烟雾喷出时仍能在空气中停留数小时，期间这些气体和粒子可被周围非吸烟人士吸入机体内，亦可能和氡气的衰变产物混合一起，造成周围人群的更大伤害。长期处于这种环境下同样可导致气管炎、癌症等不治之症的发生[3]。吸烟已成为社会公共卫生问题，虽然有各种疾病的患病风险[4]，但是中国吸烟人群仍超过3亿，烟草消耗量占世界的33.34%[5]。吸烟时烟草燃烧都会产生使人体免疫力受损的有毒物质，这些物质在吸烟产生的主流烟雾和环境烟雾中存在，目前对烟雾会使对机体免疫力下降的相关因素还没有明确阐明[6]。本研究通过将大鼠分不同时间段暴露于吸烟产生的烟雾中，观察大鼠的免疫系统变化（细胞免疫和体液免疫），进一步研究吸烟的时间效应对机体免疫功能改变影响，为探讨如何降低烟草对机体的危害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选取由中国医科大学实验中心提供的雄性Wistar大鼠30只为实验动物，大鼠月龄2个月，平均体重为（230±10）g，属健康清洁级实验动物。大鼠均先进行1周的顺应性养殖，养殖过程中严密监控大鼠的活动及饮食情况；依据大鼠自身的重量，随机分为对照组及烟草烟雾暴露组，每组各15只。给予标准饲料进行常规喂养，室温设置为（22.50±2.40）℃，相对湿度在50%～65%，自然光线下喂养。于烟草烟雾暴露即刻（T0）、1个月（T1）、2个月（T2）、3个月（T3）、4个月（T4）、5个月（T5）和6个月（T6）等不同时间段分别对两组大鼠乙醚麻醉，采内眦静脉血，进行检测。
1.2 主要实验试剂及设备
选择每支烟焦油含量12 mg，烟气烟碱量1.2 mg的沈阳烟厂生产的市售某香烟作为染毒用烟，采用PE标记的CD4、CD8单克隆抗体（美国，BD Pharmingen.）；FITC标记的抗CD3单克隆抗体（美国，Invitrogen Corp.）；EPICS XL型流式细胞仪（美国，Beckman Coulter Inc.）；选用由军事医学科学院放射医学研究所的DWRD-2型号的动式气体染毒装置。
1.3 染毒方法
将15只烟草烟雾暴露组大鼠全部置于动式气体染毒装置中暴露，对染毒物质进行燃烧，使燃烧后产生的烟雾接连泵入该装置中的染毒室内，染毒时需具备如下条件：染毒室内烟雾浓度（泵入染毒装置内烟雾体积占整个箱体空气体积的百分比）达到50%，氧气浓度达到（21.0±0.5）%，室内温度达到（22±2）℃，室内相对湿度达到（58±1）%，室内压力达到 （101 325±40）Pa。染毒时间为每周5 d，每天进行2次，每次持续30 min[7]。烟草烟雾暴露组大鼠在非染毒时期与对照组大鼠在同一环境下饲养，运动及进食饮水等活动自由。
1.4 采集样本及检测
采集大鼠外周静脉血（内眦静脉血）2 mL，给予二乙胺四乙酸（EDTA）抗凝，要求室温下保存，在标本中加入CD3、CD4或CD8等单克隆抗体，将其震荡并混和均匀，再存入4℃下冰箱内保存30 min，加入适量红细胞进行溶解；反复给予离心、弃上清等操作，直至试管底部无红色为止；应用多聚甲醛固定液进行标本固定，应用EPICS XL型流式细胞仪（美国，Beckman Coulter Inc）检测[8]。每个标本进行计数，数量为10 000个细胞，然后对阳性细胞百分比进行计算。按试剂盒说明书测定IgA、IgG、IgM、C4、C3含量。
1.5 统计学方法
将所得数据输入SPSS 16.0统计学软件，以均数±标准差（x±s）表示计量资料，相同时间点的两组间比较及不同时间比较分别采用两样本t检验或t′检验（方差不齐时）及重复测量方差分析，当Mauchly球形检验假设资料不满足时，采用Greenhouse-Geisser ε校正系数作为校正自由度；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
烟草烟雾暴露组CD3、CD4 T淋巴细胞自T3时逐渐下降（P < 0.05），CD8 T淋巴细胞自T4时逐渐上升（P < 0.05），对照组各指标各时点间均无明显差异。与对照组比较，烟草烟雾暴露组T3～T6时CD3和CD4 T淋巴细胞含量均减少（P < 0.05），CD8 T淋巴细胞含量均明显增多（P < 0.05）。T4～T6时，对照组IgG、IgM和C4含量均明显高于烟草烟雾暴露组（P < 0.05）。烟草烟雾暴露组IgG、IgM和C4、C3自T4时逐渐下降；对照组各指标各时间点间均无明显差异。见表1。
3 讨论
通过对统计学数据分析并研究，结果表明，大鼠在烟草烟雾暴露3个月时间内，大鼠的细胞免疫功能损害程度不显著，大鼠在烟草烟雾暴露3个月时间后，大鼠的细胞免疫功能开始受损明显并逐渐下降，从这一结果分析可见：烟草烟雾暴露对机体免疫系统的细胞免疫损害程度是在烟草烟雾暴露累计到一定时间后产生明显作用，并呈现逐步蓄积继而严重的过程。
研究显示，人类发生各种呼吸系统及各器官的疾病均与烟草烟雾有关。目前已被国际癌症研究机构评价并确认的致癌物中明确表示，烟草中含有的致癌物有60余种[10]，因此，长期生活在烟草烟雾环境中，发生各种呼吸系统及各器官疾病的机会显著增高[11]，职业紧张因素如工作关系、工作难度以及决定自由度等与吸烟关系密切。为了防止由于主动及被动吸烟而导致的疾病发生，WHO早已制订了“反吸烟”的主要行动策略及实现的目标[12]。
本研究的开展更加确定了机体细胞免疫功能破坏程度与主动或被动吸入烟草烟雾的时间长短的关系，在烟草烟雾暴露3个月后，将CD3、CD4和CD8 T淋巴细胞含量进行对照组与暴露组比较，暴露组出现显著改变，其中发生显著改变的T淋巴细胞还包括：总T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞，打破了细胞免疫的平衡状态，提示机体细胞免疫功能在短时期吸烟内受损伤程度不明显，主动或被动吸入烟草烟雾的时间长短与机体细胞免疫功能破坏程度成正比，即时间越长，机体破坏越严重。这也预示着吸烟时间越长，对机体的危害越严重。
本研究将大鼠分两组进行实验，且在烟草烟雾暴露的不同时间段进行动态观察，即从烟草烟雾暴露即刻（T0）开始，每小时进行1次监测，至烟草烟雾暴露6个月（T6）止，分别进行7次各相关指标的记录，此研究虽只对大鼠进行了6个月的动态监测，与长期吸烟人群所接触的环境无法模拟，但可促进有益健康的生产、生活方式的形成，减少和控制职业相关疾病与行为的发生[13]。
烟草烟雾暴露损伤细胞免疫的时间窗为3个月，具体损伤机制尚需进一步探讨阐述证明。经研究发现，大鼠机体体液免疫功能受损在烟草烟雾暴露3个月内不明显，在烟草烟雾暴露3个月后大鼠的机体体液免疫功能开始逐步降低，提示在烟草烟雾中暴露的时间长短与机体细胞免疫功能破坏程度成正比，且呈现逐步蓄积继而严重的进程。烟雾中有毒物质可对机体免疫系统造成广泛的影响，其中尼古丁不仅可导致免疫反应抑制，而且可引起T细胞免疫失衡[14]。IgA、IgG、IgM水平降低，是一种免疫功能降低的表现[15-16]。本研究通过7个时间点，观察被动吸烟对免疫功能的损伤过程，结果明确了烟草烟雾暴露对体液免疫损伤的时间效应，IgG、IgM和C4在暴露3个月后明显降低，C3及IgA分别在暴露第5个月及第6个月后发生改变，提示短期吸烟对体液免疫功能影响不大，长期可致体液免疫功能逐渐受损，具体机制尚需进一步研究证实[17]。
综上所述，烟草烟雾暴露损伤细胞免疫的时间窗为3个月，短期吸烟对体液免疫功能影响不大，长期可致体液免疫功能逐渐受损。
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（收稿日期：2014-08-25 本文编辑：苏 畅）