酶抑制法检测蔬菜中农药残留存在的不足及提高检测准确性的途径
摘要 酶抑制率比色法被广泛应用于蔬菜农药残留检测上，但是由于胆碱酯酶的特异性等因素使得该方法存在一些不足之处，使该方法的应用在一定程度上受到限制。分析了酶抑制法检测蔬菜中农药残留存在的不足，并从严格仪器、试剂和试验条件，改进前处理方法等方面提出提高检测准确性的途径，以期为酶抑制法的应用和推广提供参考。
关键词 酶抑制法；农药残留；准确性；不足；提高途径
中图分类号 TS207.5+3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）01-0104-02
农药在农业生产中具有重要作用。从不使用农药的自然农业发展到使用农药的现代农业，农药做出了积极的贡献。但是随着农药在农业生产中的用量不断加大和使用技术不规范等现象逐渐增多，其造成的环境污染以及农药残留问题越来越严重，威胁着人类的健康和安全。现在，这一问题已经引起全社会的高度重视，甚至也形成了全球的关注焦点[1]。
目前，农药残留检测的方法较多，受农药品种繁多、化学结构和性质不同、样品待测组分复杂等因素的影响，定性、定量分析农药很有必要[2]。气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法及质谱联用等传统的农药分析方法只适用于实验室检测[3-4]，因為这些方法在预处理环节操作比较麻烦，还需要花费相当长的时间进行测试，不仅所需仪器的价格昂贵，而且运行成本也不低，最重要的是仪器要求一定的使用条件，同时对操作人员也有严格要求。近年来，关于农药残留快速检测技术的研究较多，其中酶抑制比色法不仅研究最多，而且技术相对成熟，该技术的优点不仅体现在检测速度快、成本低、操作简单和便携等方面，其在不需要配备昂贵的仪器、方便操作者掌握和推广方面也占有绝对优势[5-7]。酶抑制比色法可以有效缓解专业农药残留检测机构严重不足的现状，因为该技术非常适合现场检测以及大批样品的筛选，只需要将初筛中具有阳性反应结果的样本带回去进行实验室验证即可[8-9]。
酶抑制法具有诸多优点，如检测速度快、成本低、效率高、操作简单、便携、对检测人员技术水平要求低等。因此，酶抑制法在农业领域的应用日益广泛，为了监控农药残留状况，该技术在农业生产和销售企业中被大量使用，这不仅有利于保障与提升农产品的质量安全水平，提高经济效益[10-15]，而且可以大幅降低政府实施农产品质量安全监管成本，从而提高监管效率。酶抑制法在很多农产品生产基地、乡镇农技服务站被广泛应用，因为其不仅可以在产地准出过程中实现对农产品中农药残留的快速、现场、实时检测，而且在市场准入过程中也同样能够实现对农产品中农药残留的快速、现场、实时检测。因此，酶抑制法已成为政府实施农药残留监管，实行蔬菜水果市场准入和退出制度的重要技术支撑。酶抑制法的推广使用日益广泛，其发挥的作用也越来越大，不仅体现在高毒农药残留监管的各个环节，而且渗透在打击非法生产、滥用高毒农药的工作中。
1 酶抑制法检测农药残留存在的不足之处
20世纪60年代酶抑制法问世，80年代呈快速发展之势，随着研究的不断深入，技术已相对成熟，逐渐成为目前研究最多的一种对部分农药进行残留快速检测的技术[1]。但是该技术尚存在不足之处，即检测对象不具有广谱性，目前只适用于检测某些样品和农药种类，如可以检测蔬菜、水果中残留的有机磷和氨基甲酸酯类农药。另外，该方法还比较容易出现假阳性或假阴性现象[6]，这是因为其使用的酶、底物、显色剂都具有一定的特异性，需要控制多个条件才能尽量降低影响。
1.1 检测对象仅限于有机磷和氨基甲酸酯类农药
酶抑制法的检测机理是：在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药可以抑制胆碱酯酶正常功能的发挥，而且其抑制率随着农药浓度的升高而升高，因而判断样品中是否存在高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药只要参照抑制率即可得出结论[7]。
一般酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，乙酰胆碱与显色剂发生反应，产生黄色物质，用分光光度计在412 nm处测定吸光度随时间变化值，就能够计算出抑制率。邱朝坤等以鲫鱼脑、肝脏和肌肉乙酰胆碱酯酶为检测用酶，利用酶抑制法快速检测5种蔬菜中有机磷农药残留情况。研究发现，要准确判断农药残留情况，就要借助AChE酶活抑制率和农药抑制方程。当AChE酶活抑制率>35%时，即可判断该样品中农药残留超标，该方法的回收率为80%～120%[8]。
此外，金盛烨等用酶抑制法测定有机磷和氨基甲酸酯类农药含量的研究结果表明，酶活力的抑制率随着农药浓度的升高而升高。其中，呋喃丹检测限为3.5 μg/L，对氧磷检测限为12.0 μg/L，敌敌畏检测限为25.0 μg/L，西维因检测限为50.0 μg/L，含不同浓度呋喃丹的油菜汁的回收率为108.0%～118.0%[9-10]，大白菜汁的回收率为93.2%～107.0%。
酶抑制法在农残检测方面的应用越来越受到限制，一方面该方法只限于有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测，而且与国际和国内规定的残留限量标准比较，检测限很大比例都呈偏高态势，阳性检测结果还需要采用仪器法进行准确定性定量，因此由于该方法的检测精度较低，不能够成为法律仲裁依据[5，11]。另一方面，农药品种更新较快，随着新的农药品种及用量不断增加，越来越多的农药品种在例行监测中的检出率和超标率呈上升趋势，从而被列入检测范围，如拟除虫菊酯类、三唑类等其他类别的杀虫、杀菌和除草剂。而酶抑制法对这些类别的农药却无法检测出来[5]。
1.2 检测精度不高，易受样品性质影响
分析发现，现行的技术方法及标准获得检测结果主要通过判别样品的颜色变化来确定，而判别颜色变化本身就成为阻碍检测灵敏度提高的重要因素。同时，现行方法为了不干扰样品组织液，待测样品只能从样品表面提取，对样品组织内的残留情况无法检测，从而阻碍了样品中农药残留的检出限的提高[12]。
另外，酶抑制法容易产生假阳性现象的植物，不仅是《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》（GB/T5009.199-2003）中提出的汁液中含有对酶有影响的植物次生物质的蔬菜，如葱、蒜、韭菜、芹菜、香菜、萝卜、茭白、蘑菇及番茄等，对于一些叶绿素、类胡萝卜素等色素含量较高的蔬菜也难以准确检测，使得该方法在以上这些蔬菜的主产区或生产基地上应用受到限制。
1.3 受仪器、试剂、试验条件等因素的影响较大
一是速测产品质量良莠不齐。目前市场上的速测仪产品众多，而且价格相差较大，一部分可能是伪劣产品。使用者在对有效产品进行质量判断和选择时，不仅没有相关的認定和验证程序进行检验，而且也没有国家或行业的统一标准或鉴定规程进行参考[10，13]。目前仪器设备和试剂产业也缺乏监管和规范统一的行业标准，加上厂家的行业自律意识也比较淡薄，整个产业处于混乱状态。这就造成了仪器设备和试剂市场的混乱，出现仪器性能不稳定、试剂性质差别较大等问题，导致同批次样品的检测结果的重现性不佳，对快速检测结果的准确性和可信度产生严重影响。二是检测试剂缺乏相关标准。酶抑制法的关键和核心是酶试剂，酶试剂的稳定性对检测结果的影响很大。由于酶的稳定性对环境的变化非常敏感，一旦保存或使用不当都会使其失去活性，从而影响检测结果的准确性。胆碱酯酶的制备来源广泛，如家蝇、鱼类、动物肝脏和血液以及小麦、大豆和玉米等材料，只需要将这些材料进行分离和纯化即可获得[14]。目前，各速测产品生产企业获得酶试剂的途径较多，有的通过市场直接购买，也有的利用自主分离、提取和纯化等方法制备，还有的直接委托其他单位或企业帮助生产。在质量方面这些酶的差别较大，在活性和稳定性方面也同样存在较大的差别，主要是由于酶的来源、类别、生产工艺等不同造成的。然而，目前对于我国最常用的AChE在活性、灵敏度和稳定性等性能方面缺少统一的测试和鉴定标准，这就造成市场上的酶试剂产品处于鱼龙混杂、质量参差不齐的状态。要想保证速测结果的准确性，仅仅依靠农药残留检测用BChE 的标准（NY/T 1157—2006）是完全不够的。三是缺少针对快速检测前处理环节的设备和标准。目前国内对于快速检测前处理环节的实际操作要求，主要参照国家标准《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》（GB/T5009.199—2003）。但在实际操作中容易出现误判现象，因为在实际处理时提取液的获得途径比较简单，只是样品在缓冲液中经过振荡、混匀、静置环节而已，这造成干扰物质去除困难，必须要经过净化和富集过程才行。四是样品上机前酶就已经开始与底物发生化学反应，致使△As较小，导致抑制率偏小或偏大，乙酰胆碱酯酶反应条件受环境等因素的影响较大，检测的灵敏度和回收率还有待提高。
2 提高农残快速检测准确性的途径
2.1 针对易出现假阳性及容易误判的样品
对于容易产生假阳性的样品以及色素含量较高的样品，检测时可采用整体浸泡或冲洗的方法进行提取，取蔬菜的单体，用缓冲液浸泡或反复冲洗单体，尽量减少次生物质和过多的叶绿素对酶产生的干扰，从而可以提高检测的准确性。
2.2 对有机磷和氨基甲酸酯类以外的农药检测
对除有机磷和氨基甲酸酯类以外类型农药残留的检测，目前国标或行业标准中尚无快速检测的方法，建议根据《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》（NY/T761—2008）等方法，使用气相或液相进行检测。
2.3 对因仪器误差、化学试剂和操作方法不当等原因产生的问题
基于酶抑制率原理的农药残留快速检测仪大多是在小型分光光度计的基础上研制的，技术上比较成熟，但是生产水平良莠不齐，仪器的教研管理落后，没有相关的验证程序，所以质量技术监督部门应加强对农残速测仪的认证和校验管理。检测单位在购买试剂时应尽量选用乙酰胆碱酯酶，因为相对其他酶类，乙酰胆碱酯酶与氨基甲酸酯类和有机磷类农药的特异性反应最强，而且灵敏度高，基本不受干扰。要严格注意试剂的保存条件。为了避免样品转移的损失，减少各种人为因素的偶然误差，相关研究单位应发展快速、经济、环保和便捷的样品前处理技术和自动化程度更高的速测仪器，以提高检测准确性。
另外，检测人员的素质相当重要，因为在取样、提取、加酶试剂反应等操作中，检测人员的操作在很大程度上会影响检测结果。我国省市质检机构检测人员的素质和检测水平较高，而基层速测人员由于工作开展较晚，其素质普遍较低，特别是区县、大型农贸批发市场的速测人员，大部分未经过系统的样品检测分析知识培训。因此，为了提高检测人员的综合素质，应对其加强技术和专业技能培训，使其符合农残速测工作的要求[15]。
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