肺炎克雷伯杆菌对氟喹诺酮类抗生素耐药机制探究
【摘 要】目的：肺炎克雷伯杆菌（KP）对氟喹诺酮类药物（FQNs）的耐药机制，以更好的指导临床药物治疗。方法：选择2018.6～2019.5期间临床分离对环丙沙星耐药的10株KP，为明确菌株对5种FQNs的MIC值，应用微量肉汤稀释法检测;用PCR法检测菌株染色体和质粒带有的FQNs基因（gyrA、parC与q基因）并测量序列，在试验法的支撑下检验q是否出现转移情况。结果：10株KP对5种FQNs均产生了耐药性，检测扩增产物序列后发现10株KP染色体的gyrA、parC基因均有突变，有2株菌株带有gyrA，以上2菌株的接合菌对FQNs的MIC值上升了5～30倍;未检测出qB阳性的菌株。结论：gyrA、parC基因突变是诱导KP对FQNs产生耐药性的住院原因，质粒上有gyrA基因吸附，也是形成耐药性的主要因素之一。
【关键词】肺炎克雷伯杆菌;氟喹诺酮类;药物耐药性;机制分析
【中图分类号】R978.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2019）12-03--01
FQNs是一类以萘啶酸为基础、人工合成的抗生素，在细菌感染类疾病临床治疗中有广泛应用。其作用机制是通过有目的性抑制细菌DNA回旋酶与拓扑异构酶Ⅳ的形式，对细菌DNA复制、转录与修复重组过程形成有效抑制，最后中断细菌的传代过程[1]。伴随本药品的广泛使用，随即出现的便是耐药性问题。KP是一种较为常见的条件致病菌，其发病率仅位居大纲杆菌与铜绿假单胞菌。本文主要对KP的耐FQNs进行分析与研究。
1 材料与方法
1.1 材料 选择在2018.6～2019.5期间经临床分离的10株对环丙沙星耐药（MIC≥32μg/ml）的菌株，所有菌株均采用API系统与ATB系统鉴定到种、实验质控菌株是KP ATCC700603，结合试验受体菌是大肠埃希菌j53RifR。
1.2 试剂类型 利福平、环丙沙星（CIP）、诺氟沙星（NFX） 、氧氟沙星（OFX）;药敏纸片及琼脂或肉汤培养基;Taq DNA聚合酶与dNTPs、离心机与PCR扩增仪、成像分析系统。
1.3 方法
1.2.1 抗生素药物的敏感试验 应用微量肉汤稀释法检测CIP、NFX、OFX对KP抑菌的最低浓度（MIC），质控菌株是ATCC700603，依照CLSI M100-S19（2009年）判断药敏检测情况[2]。
1.2.2 聚合酶链反应（PCR） 利用沸点法提取基因组DNA，明确PCR扩增引物类型及对应的长度、温度等，结合相关文献或引物设计引物推荐值设定反应条件。将PCR阳性产物送往Invitrogen公司检测序列。
1.3.3 质粒结合试验 筛选出q基因呈阳性的菌株进行质粒结合试验分析。操作流程可以作出如下表述：把处于相同生长期的等量供体菌与受体菌整合至新鲜的LB肉汤内充分混合，在37℃环境中持续培养5h（培养过程中禁止出现震荡行为）后，将其接种在含有利福平（300μg/mL）与CIP（0.06mg/L）的琼脂（TSA）平板上有目的性的进行培养，当观察到出现菌落生长的情况，则提示结合成功。挑选出的接合子经由PCR检测q基因阳性以后，使用API20E系统再次鉴定是否是大肠埃希菌;为进一步明确FQNs基因是否出现转移情况，则需应用微量肉汤稀释法分别检测供体菌、受体菌、接合菌对CIP的MIC值。
2 结果
2.1 10株KP对5种FQNs的检测情况 具体检测情况见表1，发现10株KP对5种FQNs均形成了耐药性。
2.2 耐药质粒轉移及药敏试验分次 K80与K108这两种菌株经过接合试验以后，发现其在选择平板上均有菌落生长繁殖，系统鉴定结果表明都是大肠埃希菌，且PCR鉴定表明含有gyrA基因。药敏分析结果表明，其对FQNs形成的耐药性可以以质粒接合为媒介转移至受体菌E.coli RifrR，促使其对FQNs的MIC至提升5～30倍。
3 讨论
既往有学者针对细菌对FQNs的耐药机制作出深刻的分析，可能的耐药机制[3]：染色体诱导的耐药，以药物作用部位的改变、外膜通透性降低以及自主外排作用等为主，FQNs作用的靶点是细菌的DNA回旋酶与拓朴异构酶Ⅳ，其中前者是由2个gyrA基因编码的GyrA 亚基与2个gyrB基因编码的GyrB亚基构成的四聚体，后者是由2个parC、parE基因编码的2个ParC、ParE亚基构成的四聚体，若有亚基变异均可导致细菌对FQNs形成耐药性。
本次研究的10株FQNs KP中，GyrA 亚基均出现了第83位氨基酸改变的情况，即83为丝氨酸（Ser）转变为异亮氨酸（Ⅱe）或者是亮氨酸（Leu）或苯丙氨酸（Phe），促使该位点的亲水性下降，FQNs与DNA回旋酶的亲和力下降，对药物耐药是其典型的外在表现形式。这提示GyrA 亚基第42位氨基酸的改变为KP对FQNs形成耐药性的主要原因。另外，还有9株菌株还出现了87位氨基酸的改变，具体是有天冬氨酸（Asp）转化为丙氨酸（Ala）与谷氨酸（Glu），这和国内部分报道相一致[4]。
质粒诱导的细菌对FQNs的耐药机制是当下国内外临床上研究的一个重点课题，其对FQNs形成的耐药性主要是由q基因介导的，其中qA基因在以上过程中占据主导地位[5、6]。在本次研究中，有2株菌株带有gyrA，以上2菌株的接合菌对FQNs的MIC值上升了5～30倍（MIC≥255μg/mL）;未检测出qB阳性的菌株。gyrA基因质粒转移至受体菌E.COLIj53.RifR，这可能使其对FQNs产生的耐药性明显上升的主要原因，但是没有抵达耐药判断的折点。
总之，gyrA、parC基因突变是诱导KP对FQNs产生耐药性的住院原因，质粒上有gyrA基因吸附，也是形成耐药性的主要因素之一。
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