靶向VEGF—C的siRNA表达载体对人乳腺癌细胞VEGF—C基因表达的影响
[摘要] 目的 探讨靶向VEGF-C的siRNA表达载体对人乳腺癌细胞MCF7增殖、凋亡及化疗敏感性的影响。 方法 针对VEGF-C的siRNA表达载体转染乳腺癌细胞，另设立转染组及转染阴性表达载体组，每组设5个复孔。观察各组细胞的VEGF-C mRNA及蛋白表达情况。 结果 阴性对照组和空白对照组VEGF-C mRNA表达率无显著差异（P>0.05）；实验组各组的表达水平均显著低于空白对照组及阴性对照组（P<0.01）；实验A组的表达又显著低于实验B组和实验C组（P<0.01）。阴性对照组和空白对照组培养液上清中VEGF-C蛋白水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；实验组各组蛋白水平均显著低于阴性对照组和空白对照组（P<0.01）；实验A组蛋白水平又显著低于实验B组和实验C组（P<0.01）。 结论 靶向VEGF-C的siRNA表达载体能够显著降低人乳腺癌细胞VEGF-C的基因和蛋白表达。
[关键词] 人乳腺癌细胞；血管内皮生长因子C；蛋白
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）10-0001-04
Effect of siRNA expression vector of targeting the VEGF-C on breast cancer cells VEGF-C gene expression
YANG Hui1 XU Xiaohong2
1.Cancer Chemotherapy Center， Ningbo Yinzhou People"s Hospital， Ningbo 315000， China； 2.Cancer Chemotherapy Center， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China
[Abstract] Objective To discuss the effect of siRNA expression vector of targeting VEGF-C on breast cancer cells VEGF-C gene expression. Methods The siRNA expression vector of targeting VEGF-C transfected breast cancer cells， and another groups of expression vector transfected and transfected with negative were established. Each group set up five wells. VEGF-C mRNA and protein expression of all groups were compared. Results VEGF-C mRNA expression of negative control group and the control group showed no significant difference （P>0.05）. VEGF-C mRNA expressions of experimental groups were lower than negative control group and the control group （P<0.01）； expression of experimental group A was lower than expressions of experimental group B and C （P<0.01）. VEGF-C protein levels in culture supernatant of negative control group and the control group showed no significant difference（P>0.05）； VEGF-C protein levels in culture supernatant of expressions of experimental groups were lower than negative control group and the control group （P<0.01）； Level of experimental group A was lower than expressions of experimental group B and C （P<0.01）. Conclusion siRNA expression vector of targeting the VEGF-C can apparently decrease VEGF-C mRNA and protein expression on breast cancer cells.
[Key words] Breast cancer cells； Vascular endothelial growth factor-C； Protein
乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤的发病中占首位。手术治疗是根治乳腺癌的主要方法，但是术后复发转移、化疗耐药可影响最终的治疗效果。近年来随着分析生物学的迅速发展，分子靶向治疗成为新的热点[1，2]。血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是VEGF家族的成员之一，与内皮细胞膜表面的血管内皮生长因子2、3结合，促进血管及淋巴管的增生，参与肿瘤的生长及转移过程[3，4]。VEGF-C结合肿瘤细胞表面的受体后，能促进细胞的增殖，并能阻止细胞凋亡，降低肿瘤细胞的化疗敏感性，靶向抑制VEGF-C基因的表达，对抑制肿瘤细胞的增殖具有一定的临床意义。本研究主要探讨靶向VEGF-C的siRNA表达载体对人乳腺癌细胞VEGF-C基因表达的影响，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 一般材料
实验研究时间：2013年4月～2014年12月。MCF-7人乳腺癌细胞株购自上海生博生物医药科技有限公司。靶向VEGF-C的siRNA真核表达质粒，阴性对照质粒。主要试剂：培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、脂质体LipofectamineTM 2000、Trizol试剂、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker Ⅱ、人VEGF-C ELISA试剂盒、SABC 组化试剂盒、DBA试剂盒、琼脂糖、DEPC等。主要仪器：CO2恒温培养箱、恒温水浴箱、核酸蛋白检测仪、离心机、电泳仪、电泳槽、PCR仪、酶标仪。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞复苏、培养、传代 乳腺癌细胞株经复苏后，接种于培养瓶中，37℃，5%CO2恒温培养，细胞80%融合时，进行传代继续培养。
1.2.2 质粒转染细胞 （1）转染用重组质粒DNA纯化、定量。质粒抽提试剂盒提取靶向VEGF-C重组质粒（pRNAT-VEGF-C-1、pRNAT-VEGF-C-2、pRNAT-VEGF-C-3）及阴性对照质粒（P-N）。（2）转染细胞。将细胞转入24孔培养板，每孔3×105个，培养24 h，细胞达到90%融合。分别对细胞进行分组：空白对照组，未转染；阴性对照组，转染阴性对照质粒；实验A组转染pRNAT-VEGF-C-1质粒；实验B组转染pRNAT-VEGF-C-2质粒；实验C组转染pRNAT-VEGF-C-3质粒。制备脂质体/质粒DNA混合物。洗净培养板各孔培养液，采用DMEM培养液清洗细胞2遍，加入DMEM培养基500 μL，加入脂质体-DNA复合物，总体积600 μL。每组5个复孔。空白对照组仅加DMEM培养基。37℃，5%CO2恒温培养6 h，换液，加1 mL含10%FCS的DMEM过夜。
1.3 检测方法
1.3.1 采用RT-PCR法检测转染细胞中VEGF-C mRNA表达 （1）提取总RNA。（1～5）×106细胞移入EP管中，离心，去上清。加入Trizol 1 mL混匀，室温下放置5 min，加入氯仿200 μL，震荡15 s，室温下放置3 min。4℃离心15 min，将水相转移到EP管中，加入等体积异丙醇混匀，放置20～30 min，4℃离心10 min，去上清，加75%乙醇1 mL洗涤沉淀。4℃离心5 min，倒出液体再次离心后，枪头吸出少量液体，留下沉淀。室温晾干，重复溶解RNA。4 μg RNA逆转录为cDNA。（2）PCR扩增。VEGF-C引物和β-actin引物由上海博雅生物公司合成提供。反应体系12.5 μL。琼脂糖点凝胶电泳，分析电泳结果，VEGF-C表达率采用其吸光度值与内参照β-actin吸光度值比例表示。
1.3.2 采用ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF-C蛋白的表达 （1）每孔3×105个细胞接种于24孔培养板内，37℃，5%CO2培养24 h，细胞转染。设置空白对照组、阴性对照组、实验A组、实验B组、实验C组，同mRNA检测。每组5个复孔。转染后48 h，收集上清，采用ELISA法检测上清液中的VEGF-C蛋白水平。
1.3.3 采用免疫细胞化学染色法检测细胞内VEGF-C蛋白的表达水平 取对数生长的乳腺癌细胞，每孔3×105个接种于放有载玻片的培养板内，37℃，5%CO2培养24 h。细胞布满80%后，进行细胞转染，步骤和分组同上。每组5个复孔。采用免疫细胞化学染色法检测细胞内VEGF-C蛋白表达。转染后48 h，取出培养板，吸净培养液，加甲醛固定，PBS冲洗3遍。取出载玻片，去离子水孵育，消除内源性过氧化物酶，加封闭液，加一抗过夜，加生物素化山羊抗小鼠IgG，孵育20 min。PBS冲洗共3次，加SABC，孵育20 min，PBS冲洗共4次。DAB显色，苏木素复染，二甲苯脱水，封片。
1.4 统计学方法
采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差表示，采用方差分析及t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒对乳腺癌细胞VEGF-C mRNA表达的影响
空白对照组表达率为（98.6±2.4）%，阴性对照组表达率为（98.1±2.0）%，实验A组表达率为（38.2±1.6）%，实验B组表达率为（64.2±1.8）%，实验C组表达率为（67.9±1.9）%。阴性对照组和空白对照组VEGF-C mRNA表达率无显著差异（P>0.05）；实验组各组的表达水平均显著低于空白对照组及阴性对照组（P<0.01）；实验A组的表达又显著低于实验B组和实验C组（P<0.01）。见图1。
2.2重组质粒对乳腺癌细胞培养液上清液中VEGF-C蛋白水平的影响
阴性对照组VEGF-C蛋白水平为（383.51±30.26）pg/mL，空白对照组为（368.80±38.91）pg/mL，实验A组为（116.38±25.16）pg/mL，实验B组为（277.42±30.11）pg/mL，实验C组为（291.46±33.15）pg/mL。阴性对照组和空白对照组培养液上清中VEGF蛋白水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；实验组各组蛋白水平均显著低于阴性对照组和空白对照组（P<0.01）；实验A组蛋白水平又显著低于实验B组和实验C组（P均<0.01）。见图2。
2.3 重组质粒对乳腺癌细胞内VEGF-C蛋白表达的影响
各组乳腺癌细胞内VEGF-C蛋白表达情况见图3～7。VEGF-C蛋白阳性可见胞浆内棕黄色颗粒。阴性对照组和空白对照组染色颜色均较深，为棕黄色，实验A组、实验B组和实验C组染色均较阴性对照组和空白对照组浅，而又以实验A组染色最浅。
3讨论
VEGF-C是血管内皮生长因子家族成员，具有促进血管增生的作用，在肿瘤的生长和转移过程中发挥重要的作用。而癌症细胞分泌VEGF-C与其自身膜受体结合，能够促进癌症细胞的增殖，抑制癌细胞凋亡，降低癌细胞对化疗药物的敏感性。VEGF-C在乳腺癌细胞中呈高表达[5]。目前针对VEGF-C为靶点的治疗主要有抑制VEGF-C受体的酪氨酸激酶活性、抗体封闭、降低VEGF-C及其受体的表达，但这些技术或方法均有一定的局限性。RNA干扰由双链RNA介导的序列特异的同源基因经转录后发生的基因沉寂现象，其作用机制是小干扰RNA（siRNA）作为中介分子，与其他一些蛋白质构成沉默复合物，按照碱基互补规律，识别降解与siRNA同源的mRNA[6-8]。siRNA干扰是一种高效的、特异的基因表达抑制技术，广泛用于基因治疗相关的研究。该技术经人工合成靶向的siRNA，或者构建相应的载体，导入肿瘤细胞，能够特异性抑制基因的表达。
1996年VEGF-C首次从前列腺肿瘤细胞中被分离出来，与VEGF家族其他成员具有同源性。VEGF-C在人类多种恶性肿瘤中均有高表达。VEGF-C在肿瘤组织中的高表达，结合肿瘤周围组织淋巴管内皮细胞内VEGF-R3，诱发形成肿瘤相关淋巴管，增加淋巴管与肿瘤细胞的接触，促进肿瘤细胞自淋巴管发生转移[9，10]。表达VEGF-C的乳腺癌细胞更具有侵袭性，更容易经淋巴管转移。正常的乳腺组织并不表达VEGF-C及VEGFR-3，而乳腺癌组织中会出现不同程度表达率，并且有淋巴结转移者其表达高于无淋巴结转者。研究显示，肿瘤细胞分泌VEGF-C，特异性结合自身表面受体，促进肿瘤细胞的增殖，上调Bcl-2/Bax值，抑制癌细胞的凋亡，降低癌细胞的化疗敏感性。目前针对VEGF-C及其受体的抗肿瘤治疗方法有多种方式。目前已经发现，利用转基因技术，使具有正常免疫力的小鼠MT-450乳腺癌模型中的乳腺癌细胞异位表达VEGFR-3-Ig，具有阻断VEGF-C活性的效果，抑制局部转移及肺转移。抗纤维蛋白溶酶能够抑制VEGF-C水解，阻止其不能结合VEGF-R3。这些基因靶向治疗方法能够发挥作用，但具有一定的局限性。
RNA干扰具有高效、高特异性的效果，采用该技术抑制VEGF-C的基因表达，为肿瘤治疗提供了一种新的方法。siRNA为与目的基因同源的RNA，通常19～25个核苷酸长度，转染靶细胞，与内切酶形成诱导沉默复合体，以siRNA为模板，识别并剪切、降解同源基因mRNA，形成瀑布效应，使细胞表现为目的基因缺陷表型。RNA干扰技术具有高效、特异、毒性小等优点，能够高效抑制特定基因的表达，与反义核苷酸技术比较，具有更简易、方便的特点[11，12]。
MCF-7乳腺癌细胞株属于高表达VEGF-C细胞株，因此本次研究选择此细胞株作为研究对象。siRNA的干扰作用具有剂量和时间依赖性，转染后24～48 h，干扰效应逐渐明显，48～72 h达到最高，因此本次实验以转染后48 h为检测点[13，14]。RT-PCR是测定目的基因表达情况的常用方法，具有简便、半定量的效果。VEGF-C/β-actin比值表示VEGF-C基因的相对表达量。本次研究中，阴性对照组及空白对照组VEGF-C基因表达相当，而实验A组、实验B组和实验C组表达明显降低，又以实验A组的基因表达率最低。VEGF-C属于分泌蛋白，对培养液上清液中VEGF-C水平的检测采用ELISA法，以检测乳腺癌细胞VEGF-C的分泌情况。结果显示，实验A组、实验B组和实验C组上清液中VEGF-C水平显著低于空白对照组和阴性对照组，又以实验A组水平最低。这两个结果均提示RNA干扰后乳腺癌细胞VEGF-C基因表达及分泌水平显著下降，又以pRNAT-VEGF-C-1质粒转染的抑制作用最强。本次研究观察各组细胞中VEGF-C蛋白表达水平，结果显示细胞浆中可见呈棕黄色颗粒。阴性对照组和空白对照组染色较深，而RNA干扰后实验A组、实验B组和实验C组染色程度均较阴性对照组和空白对照组浅，而以实验A组的染色更浅。提示RAN干扰能够抑制乳腺癌细胞VEGF-C蛋白的表达，尤其以pRNAT-VEGF-C-1质粒转染的抑制作用最强。
综上所述，靶向VEGF-C的siRNA表达载体可抑制人乳腺癌细胞VEGF-C基因、蛋白的表达，对蛋白分泌有抑制作用，而不同的质粒转染效果也存在一些差异，以pRNAT-VEGF-C-1质粒的抑制效果最显著。
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（收稿日期：2014-12-03）