多形性胶质母细胞瘤中RAD18的表达及与放射抵抗的关系

报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2017年10月～2018年10月收治的80例放射治疗的多形性胶质母细胞瘤患者为研究对象， 患者均经临床诊断及检查确诊为多形性胶质母细胞瘤， 经影像学检查及手术证实是否复发， 患者均知情同意并排除不愿参加本次研究者及合并严重精神障碍者。患者根据是否复发分为观察组（复发）和对照组（原发）， 各40例。观察组男22例、女18例;年龄35～61岁， 平均年龄（48.82±4.61）岁;发病部位：额叶27例、顶枕叶12例、颞叶1例。对照组男19例、女21例;年龄36～62岁， 平均年龄（49.57±4.53）岁;发病部位：额叶26例、顶枕叶13例、颞叶1例。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法 分别收集NHAs及胶质瘤细胞， 利用冰磷酸盐对其漂洗2次， 加入RIPA裂解液后于5 min冰上静置。展开超声破碎细胞， 吸入预冷的1.5 ml EP管中， 总共10～20次， 1～2 s/次， 5～10 s间隔后进行下一次。随后将其离心30 min， 转速选择最高。应用Bradford试剂盒对RAD18蛋白浓度展开检测。取等浓度蛋白样品置于碧云天生物技术研究所提供的12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶中电泳， 跑胶1.5 h， 分离胶部分90～100 V， 积层胶部分50～60 V。然后将胶转至聚偏二氟乙烯膜上。膜上加入1︰250稀释的鼠抗人RAD18一抗， 于室温下2 h孵育。随后对其进行15 min的洗膜， 总共3次。将经1︰1000稀释的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗加入其中， 再次孵育， 与之前相比， 温度相同， 时间由原来2 h减至1 h， 洗膜次数一致。观察信号时使用增强化学发光免疫分析技术。参照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书， 对有抗性的细胞进行筛选。

将人脑胶质瘤细胞系A172分别转染空白和装有RAD18的质粒载体， 应用克隆实验检测经相同剂量射线照射后两组细胞增殖情况， 用Western blot检测两组RAD18变化。采用qRT-PCR方法检测原发性及放射性粒子近距离治疗后复发性GBM样本中RAD18 mRNA的表达情况， 分析RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗的相关性。

1. 3 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验;RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗采用相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

人脑胶质瘤细胞系A172中RAD18蛋白表达为（0.17±0.03）， 与NHAs的（0.18±0.02）比较差异无统计学意义（t=1.754， P>0.05）。转染RAD18质粒的A172细胞中RAD18蛋白表达及γ射线照射后细胞克隆形成数量分别为（0.91±0.09）和（157.25±15.13）， 显著高于转染空白质粒的A172细胞的（0.22±0.02）和（55.24±5.31）， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。复发性多形性胶质母细胞瘤（观察组）的RAD18 mRNA表达为（14.12±1.21）， 显著高于原发性多形性胶质母细胞瘤（对照组）的（7.18±0.71）， 差异具有统计学意义（t=31.286， P<0.05）。经直线相关分析， RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗呈正相关（r=0.621， P<0.05）。

3 讨论

RAD18参与多种蛋白酶的表达， 是一种泛素蛋白酶体系统的重要成分， 不仅能维护细胞正常活性， 还能对遗传物质稳定性起关键作用[2]。在放射治疗时， RAD18会因DNA损伤被招募至DNA损伤处， 利用RAD18对DNA双链断裂修复能力， 与泛素结合酶RAD6结合形成二聚体， 从而抑制细胞凋亡， 促使增殖细胞核抗原发生单泛素化， 在单泛素化后会向下游的效应器发出信号， 以此招募DNA聚合酶， 达到修复的目的。除此以外， RAD18不仅对跨损伤DNA合成有调节作用， 对氧化损伤也能起到修复作用。相关研究表明[3-5]， RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗有关。本研究显示RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗有关， RAD18的细胞修复能力会导致放射抵抗的发生， 与文献[6， 7]报道基本一致。复发性多形性胶质母细胞瘤的RAD18 mRNA表达量显著高于原发性， 其原因可能在于当患者细胞DNA受到放射治疗引起损伤后， RAD18会对损伤起到修复作用， 导致DNA的修复能力得到极大提升， 这也是实验结果显示RAD18升高的原因， 在此情况下， 能减少肿瘤细胞， 导致多形性胶质母细胞瘤患者产生放射抵抗， 因此， 证实了本次研究结果， 即RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗存在相关性。根据此结果， 临床若以RAD18为靶点， 应用RNA干扰技术特异性抑制RAD18表达， 或许能够缓解多形性胶质母细胞瘤患者产生放射抵抗， 为放射治疗提高疗效。

综上所述， 放射治疗会导致DNA损伤， RAD18会修复此损伤， 引起患者放射抵抗， 临床在治疗时， 可采用RNA干扰技术， 专门针对RAD18进行抑制， 减少RAD18在放射过程中的作用， 提升治疗效果。

参考文献

[1] 罗铭， 蔡望青， 李凯舒， 等. PDLIM4基因对胶质瘤预后及胶质瘤细胞放射敏感性的影响. 中华放射医学与防护杂志， 2017， 37（10）：725-729， 762.

[2] 赵建辉. miR-124和miR-137在胶质母细胞瘤中的抑癌作用及其机制研究. 第四军医大学， 2016

[3] 姚智强， 姚兰， 贾竹敏， 等. IL1RN和IGLV基因与多形性胶质母细胞瘤放疗关系的研究. 医药论坛杂志， 2012， 33（6）：1-2.

[4] 白璐， 王亮， 周凌然， 等. 腫瘤干细胞在食管癌放射线抵抗中的作用及分子机制研究. 中华放射肿瘤学杂志， 2016， 25（4）：401-406.

[5] 徐延斌， 麻旭东， 谢晨， 等. 脑胶质瘤中RAD18的表达与放射治疗抵抗相关性分析. 实用肿瘤学杂志， 2017， 31（4）：289-293.

[6] 王成德， 李群， 卢江龙， 等. miR-181家族在胶质母细胞瘤中的表达及其临床意义. 浙江医学， 2017， 39（18）：1518-1523.

[7] 李艳霞. 脑胶质瘤放射治疗的预后因素分析. 山西医科大学， 2007.

[收稿日期：2019-02-11]

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