松花菜花球腐烂病病原分离鉴定及室内药剂筛选

材料与方法

1.1 病样采集及病原菌分离

2012-2014年连续在浙江省杭州市萧山区舒兰农场、农一场、浙江勿忘农种业股份有限公司萧山基地进行田间调查，采集已发病且具有典型症状的松花菜病株，装入干净牛皮纸袋中，带回实验室。取病健交界处组织，进行表面消毒后，采用平板画线分离法在 NA培养基（蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蔗糖5 g，牛肉浸膏3 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2）上分离纯化[3]，分离纯化的菌株接入NA试管中，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 致病性测定

健康松花菜幼苗由萧山农业技术推广中心提供，当苗长至5片叶时转移到含600 g 基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩=4∶1∶1）的盆（250 mm×240 mm）中，置于温室中，定时定量浇水和浇灌营养液；当松花菜长出花球后，用于1.1节中分离菌株的致病性测定。将分离纯化的5株菌株，在NA培养基上培养36 h后，用无菌水洗脱细菌菌苔制成浓度约为108cfu/mL菌悬液，采用喷雾法接种于健康的松花菜花球上，针刺接种法接种于花梗和叶片主叶脉上，伤口法（用灭菌的手术剪蘸取菌液后在健康叶片上剪口）接种于叶片上，每株菌接种5株松花菜，以无菌水为对照，接种后套塑料袋保湿。定期观察接种组与对照组花球、花梗、叶片和叶片主叶脉上的症状变化，记录结果，待发病后从病斑上再次分离病原菌。

1.3 病原菌培养性状与形态特征观察

供试病原菌在NA平板培养基上培养48 h后观察菌落形态，同时挑取培养了16～20 h的菌体，参照Schaad等[4]的方法进行革兰氏染色。

1.4 病原菌16S rDNA扩增及序列分析

参照Liu等[5]的方法提取细菌基因组DNA，根据Edward等人[6]发表的细菌16S rDNA基因通用引物对分离的菌株进行PCR扩增。正向引物P1为：5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG3′；反向引物P2为：5′ACGGTTACCTTGTTACGACTT3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 反应体系为：10×PCR 缓冲液（含Mg2+）5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，引物P1和P2（10 mmol/L）各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq 酶（5 U/mL）0.5 μL，加ddH2O至总体积 50 μL；反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火l min，72 ℃延伸2 min， 35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收目标DNA片段，由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果用BLAST 软件在GenBank上进行同源性比较。

1.5 病原菌的脂肪酸（FAME）鉴定

FAME 鉴定采用美国Agilent 6890 型气相色谱系统。参照MIDI 公司说明书及Xie等[7]的方法进行。供试菌株在TSBA培养基（30 g胰蛋白胨大豆肉汤，15 g琼脂，1 000 mL蒸馏水）上，于28 ℃生长36 h后，用无菌接种环挑取一环培养菌放入有螺帽的试管中，提取脂肪酸。鉴定结果通过微生物鉴定系统软件[美国MIDI 公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的MIS 4.5（microbial identification system）和LGS 4.5（library generation software）]获得。把分析结果与数据库中标准菌种的脂肪酸信息进行比对。

1.6 病原菌的Biolog鉴定

采用Biolog公司生产的GN（革兰氏阴性菌）测试板和GN数据库，按照操作规程进行鉴定。病原菌在Biolog通用培养基BUGM （Biolog universal growth medium，51.7 g BUA琼脂培养基，950 mL蒸馏水）上25 ℃培养24 h后用Biolog自动微生物鉴定系统进行鉴定。

1.7 室内杀菌剂筛选

1.7.1 供试杀菌剂

供试杀菌剂共8种，分别是：42% 三氯异氰尿酸可湿性粉剂（湖南省海洋生物工程有限公司）；20%噻菌铜悬浮剂（浙江龙湾化工有限公司）；20%噻唑锌悬浮剂（浙江新农化工股份有限公司）；72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂（华北制药股份有限公司）；3%中生菌素可湿性粉剂（深圳诺普信农化股份有限公司）；46%氢氧化铜水分散粒剂（美国杜邦公司）；50%氯溴异氰尿酸可溶粉剂（河南银田精细化工有限公司）；聚六亚甲基双胍盐酸盐（PHMB）可溶性粉剂（海宁中联化学有限公司）。

1.7.2 试验方法

室内有效杀菌剂筛选采用KB滤纸片扩散法[8]，菌株在NA培养基上培养24 h后，用灭菌水配成浓度约为108 cfu/mL的细菌悬浮液，采用无菌棉棒均匀涂布于NA平板表面，涂菌后室温干燥3～5 min。

初筛时，将8种药剂配制成5 000 mg/L，用无菌镊子夹直径为6 mm的灭菌滤纸片浸泡于配制好的药液中，浸泡片刻后立即将纸片平放于直径为9 cm含菌NA平板表面，每皿贴3张纸片，以浸泡灭菌水的纸片为对照， 重复3次，置于28 ℃培养箱中培养[9]，培养36 h后观察测量抑菌圈直径。

将初筛试验中产生抑菌圈的药剂，继续配制成浓度为2 000、1 000、500、200、100 mg/L的药液，用上述同样的方法测定抑菌圈直径。

1.7.3 数据统计与分析

统计不同药剂的不同浓度处理下的抑菌圈直径，采用SPSS 16.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 病害田间症状

引起松花菜花球腐烂病的病菌主要危害花球、花梗，也能够侵染叶片。该病害最典型的症状是在花球或花蕾上形成深褐色斑点然后腐烂。花球发病初期出现黄色、黄褐色水渍状斑点（图1a），随后斑点扩大并增加，由黄褐色转呈深褐色或黑色并腐烂（图1b），病斑从花蕾向花梗扩展，形成“V”字形黑色病斑（图1b），潮湿时病部组织用手触摸有黏腻感。叶片发病从叶缘开始向叶内和两侧呈“V”形扩展，病健交界处不明显，病斑边缘常具黄色晕（图1c），但田间调查发现叶片较少表现出症状。

2.2 病原菌分离与致病性测定

从具有典型花球腐烂病症状的松花菜病健交界处取样，制成临时玻片，在光学显微镜下观察，可见从病组织中喷出大量细菌。从病部共分离纯化到12株细菌菌株，分别是XHC1、XHC2、XHC3、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、SHC5、SHC6、SHC7、SHC8和SHC9。

将上述12株菌株在NA平板上画线培养36 h，然后分别接种到健康的松花菜花球、花梗、叶片和主叶脉上。结果表明，菌株之间的致病性有差异，花球、花梗、叶片和主叶脉上接种菌株XHC1、XHC2、SHC4、SHC7、SHC8、 SHC9后不发病；而接种菌株XHC3、SHC1、SHC3、SHC5、SHC6后第3～7天出现典型症状（图1d～g），且病斑症状与田间症状一致，从接种后发病部位分离的菌株与供试细菌菌株的菌落特征相同，而接种无菌水的对照未见任何症状。选取菌株XHC3、SHC1、SHC3、SHC5、SHC6进一步进行鉴定。

2.3 病原菌培养形状与形态特征观察

从病部分离纯化的细菌菌株在NA培养基上画线培养后48 h出现形态一致的单菌落，菌落直径约为1～2 mm，黄色，圆形凸起，边缘整齐，菌落较稠，乳脂状不透明（图1i），革兰氏染色反应阴性。

2.4 病原菌16S rDNA扩增及序列分析

以菌株XHC3、SHC1、SHC3、SHC5、SHC6的总基因组DNA 为模板，用引物P1和P2进行PCR 扩增，均扩增出约1.5 kb 的PCR 产物（图2），产物纯化回收后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。结果表明，5株菌的测序结果一致。将SHC1的测序结果提交至NCBI 的核酸数据库（登录号为KP182149），用BLAST 软件进行同源性比较，通过与GenBank 中的核酸数据进行比对分析，结果表明分离菌株与野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris）（登录号为KF057196.1）相似度最高，为99%。

2.5 病原菌的脂肪酸（FAME）鉴定

FAME 鉴定结果匹配程度遵循Buyer等[12]的原则：相似性系数<0.2，结果不可用；相似性系数≥0.5，鉴定到种。供试病原细菌菌株XHC3、SHC1、SHC3、SHC5、SHC6的FAME鉴定结果与16S rDNA的鉴定结果一致，与X.campestris pv. campestris最相似，相似度分别为0.75、0.76、0.73、0.68、0.72。

2.6 病原菌的Biolog鉴定

供试菌株XHC3、SHC1、SHC3、SHC5、SHC6在BUGM培养基上培养24 h后，经Biolog自动微生物鉴定系统鉴定，结果表明，5株菌与X.campestris pv. campestris相似系数均大于0.5，分别是0.73、0.70、0.69、0.75、0.71。

2.7 室内药剂筛选结果

KB灭菌滤纸片法试验结果表明：供试的8种杀菌剂对松花菜花球腐烂病菌的抑菌作用不同。72%农用硫酸链霉素WP、PHMB和三氯异氰尿酸对病菌有较好的抑制作用，其中PHMB在浓度为100 mg/L时仍有明显的抑菌圈产生，中生菌素对病菌的生长有一定的抑制作用，而氯溴异氰尿酸仅在高浓度下对病菌有一定的抑制作用，氢氧化铜从高浓度到低浓度都可见抑菌圈，但都很小；噻唑锌和噻菌铜在高浓度下对病菌也无抑制作用（表1）。

3 结论与讨论

（1）从浙江省杭州市萧山区采集的典型松花菜花球腐烂样本中分离的菌株，经致病性测定、病原形态观察、16S rDNA序列分析、脂肪酸鉴定和Biolog鉴定，明确为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种[Xanthomonas campestris pv. campestris （Pammel） Dye]。此菌也称甘蓝黑腐病菌。大量文献记载：甘蓝黑腐病菌引起十字花科蔬菜黑腐病，在我国主要危害甘蓝、结球白菜、不结球白菜、薹菜、芥菜、花椰菜、球茎甘蓝、芥蓝、青花菜、抱子甘蓝、芜青甘蓝、羽衣甘蓝、紫甘蓝、萝卜、荠菜等10余种十字花科蔬菜[10]，该病菌主要危害十字花科蔬菜的叶片、叶柄和叶脉，对松花菜花球的危害却鲜有报道。在浙江省调查的松花菜上，该病原菌主要危害花球，田间叶片很少见到症状，因此，我们把引起浙江省松花菜花球腐烂的病害称为“松花菜花球腐烂病”。

（2）本次试验测定了8种杀菌剂对病原菌株的抑菌效果，结果表明PHMB、农用硫酸链霉素和三氯异氰尿酸对病菌的抑制效果较好，中生菌素也有一定的抑制效果，而噻唑锌、噻菌铜对该病菌无抑制作用。测定结果可为松花菜花球腐烂病的田间药剂试验提供基础，但由于采用滤纸片法测定，结果受到药剂溶解性和扩散能力的影响，具一定局限性，同时也与药剂产品批号等有关。

（3）聚六亚甲基双胍盐酸盐是一种广谱抗菌素，对细菌、真菌和酵母菌等均有杀灭作用，长期以来被广泛用于医药行业，以及化妆品、个人护理产品、纺织品、食品工业等[7]。本次试验表明PHMB对松花菜花球腐烂病病原菌具有较好的抑制作用，可为今后PHMB用于植物病害防治提供参考。

参考文献

[1]顾宏辉， 赵振卿， 盛小光， 等. 浙闽山地松花菜关键栽培技术[J]. 中国蔬菜， 2011（21）： 5657.

[2]顾宏辉， 赵振卿， 盛小光， 等. 浙江山地和平原地区松花菜栽培施肥关键技术[J]. 中国蔬菜， 2011（20）： 6465.

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[4]Schaad N W， Jones J B，Chun W.Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria [M].3rd Edition.USA：American Phytopathological Society， 2001.

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[6]Edward U， Rogall T， Blocker H，et a1. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA [J]. Nucleic Acids Research， 1989， 17（19）： 78437853.

[7]Xie Guanlin， Soad A， Swings J， et al. Diversity of gram negative bacteria antagonistic against major pathogens of rice from rice seed in the tropic environment[J]. Journal of Zhejiang University （Science）， 2003， 4（4）： 463468.

[8]谭瑶，赵清，舒为群，等.KB纸片扩散法药敏试验[J].检验医学与临床，2010，7（20）：22902291.

[9]牛艺儒，宁官保.大肠杆菌的药敏试验[J].动物科学与动物医学，2005（12）：3031.

[10]李明远.十字花科蔬菜黑腐病的发生与防治[J].当代蔬菜，2004（11）：36.

[11]李杨，李付刚.聚六亚甲基双胍盐酸盐的合成及应用[J].精细化工原料及中间体，2011（2）：2729

[12]Buyer J S， Roberts D P， Russek C E. Soil and plant effects on microbial community structure [J]. Canadian Journal of Microbiology， 2002， 48（11）： 955964.

（责任编辑：杨明丽）

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