高通量测序技术在鉴定木本植物双生病毒中的应用

摘要

高通量测序技术（nextgeneration sequencing， NGS）平台提供了一种高效、快速、低成本、深度测序DNA的解决方案，2009年该技术开始被应用于植物病毒学领域，包括新病毒的发现，病害病原的鉴定，病毒基因组多样性及进化的研究，显著加快了植物病毒学的发展进程。迄今，应用高通量测序技术已经成功鉴定了上百种新的植物病毒和类病毒。双生病毒是一类对多种作物造成毁灭性危害的DNA病毒，多发生于草本作物。然而利用高通量测序技术，从柑橘、葡萄、苹果和桑树等多种多年生木本植物中检测到了新的双生病毒，显示出了高通量测序技术所独有的、传统检测技术所不具备的优势。本文围绕高通量测度技术在植物病毒学领域的应用进行概述，重点阐述NGS用于检测木本植物双生病毒的几个实例。

关键词

高通量测序；双生病毒；植物病毒诊断；木本植物

中图分类号：S 432.41

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.06.001

Abstract

Nextgeneration sequencing （NGS） platforms provide highly efficient， rapid， lowcost highthroughput DNA sequencing. Since 2009， NGS has been applied to plant virology， including discovery of novel viruses， identification of pathogens and analysis of genome diversity and evolution， which speeds up the process of plant virology research. Over one hundred novel plant viruses and/or viroids have been successfully identified by NGS so far. Geminiviruses （Family Geminiviridae） with circular， singlestranded DNA genome have caused devastating effect on many crops. To our knowledge， most of them generally infect herbaceous plants. However， many new geminiviruses， recently identified by NGS， were detected from perennial woody plants like citrus， grapevine， apple and mulberry. These studies have shown the superiority of NGS technology over conventional detection protocols. This paper reviews the application of NGS in plant virology and mainly demonstrates its application in detection of geminiviruses from perennial woody fruit trees.

Key words

nextgeneration sequencing；geminiviruses；diagnosis of plant virus；perennial woody plant

1高通量测序技术

1.1高通量测序平台的建立及应用

2005年，传统的桑格测序技术 （Sanger sequencing）遭遇了革命性的冲击，更准确、更快速的高通量测序技术诞生了[1]。美国罗氏公司的Roche 454测序平台的推出，开创了高通量测序的先河，此后，美国Illumina公司和ABI公司相继推出Solexa[2]和SOLiD [34] 测序技术。高通量测序技术的诞生是基因组学领域一个具有里程碑意义的事件[57]，为现代生命科学的研究提供了前所未有的机遇[8]。

与传统的桑格测序相比，高通量测序技术在测序速度和通量上有了巨大提高，测序成本也大大降低。以人类基因组计划为例，2001年，人类基因组草图发表，宣告人类基因组计划初步完成，这项研究耗时15年，花费了近30亿美元[9]。而如今应用最新的HiSeq X 测序平台，能够在一天内测序45个人类基因组，并且每个基因组测序仅需1 000美元。相比传统测序方法有了量的提高和质的飞跃，这将推动更多物种遗传信息的解密，跨入基因组信息的大数据时代。

目前，高通量测序技术在分子生物学领域的应用包括：全基因组测序 （wholegenome sequencing）[1012]，外显子组测序 （exome sequencing）[1314]，目标区域测序 （targeted regions sequencing， TRS），未知基因组的从头测序 （de novo sequencing），总RNA和mRNA测序 （RNASeq），小RNA和非编码RNA测序[15]，以及表观基因组学领域的DNA甲基化测序[16]，核糖体图谱和ChiP测序[17]等，为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学的研究提供了重要的数据信息[8]。

1.2高通量测序平台的比较

在过去的10年里，高通量测序技术平台经历了不断的改进，美国Illumina和Roche等生物科技公司相继推出不同原理、不同应用特性、功能更强大的测序仪，单次测序反应数据量也由2005年的1G增长至1T，提高了1 000倍[18]（表1）。依据测序原理的不同，目前常用的测序方法有连接法测序（sequencing by ligation， SBL）及使用合成法测序 （sequencing by synthesis， SBS）的循环可逆终止法（cyclic reversible termination， CRT）和单核糖核酸增加法（singlenucleotide addition， SNA）[19]。对各大测序平台比较发现[19]，NGS研究最常用的是Illumina平台， Illumina的产品覆盖了从低通量的MiniSeq到超高通量的HiSeq X系列，其中HiSeq X系列最多可以在一年内产生1 800多个30×覆盖度的人类基因组数据量。目前Illumina测序仪能测得的最长读长为300 bp，并且运行稳定、数据可靠、性价比高，这些优势决定了其在短读长测序上的广泛应用。Roche 454平台和Ion Torrent平台能够提供较长的读长，大约为700 bp与400 bp，因而在基因组结构较为复杂的研究上应用相对较多，然而与Illumina平台相比，其高昂的费用，低通量等缺点限制了它们的广泛应用。以连接测序法为原理的SOLiD 5500测序平台能够测得75 bp的读长，准确率虽高，但由于读长太短，运行时间太长等硬伤限定了其实用性。同样测序原理的华大基因的BGISEQ500平台，采用探针锚定聚合技术 （cPAS）能够进行单、双端测序，提供一站式测序体验，测得的最长读长达100 bp，快速、灵活、可拓展是该平台的优势。Qiagen的GeneReader是专为临床诊断设计的，主要应用于肿瘤基因上，应用面较窄（表1）。

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