秦艽不同醇提物的抑菌作用比较

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黄色葡萄球菌（ATCC25923），表皮葡萄球菌（ATCC12228），粪肠球菌（ATCC29212），福氏志贺菌（CMCC51572）均为宁夏医科大学临床医学院检验中心杨秀琴老师馈赠。

1.1.2 药品及试剂 秦艽药材购自宁夏六盘山药材种植有限公司，经张守宗高级农艺师鉴定为龙胆科植物秦艽（Gentiana macrophylla Pall），自然晾干，粉碎过药典二号筛，备用。牛肉膏、蛋白胨和琼脂均购于北京奥博星生物技术有限公司、无水乙醇（西安化学试剂厂）。

1.1.3 仪器与设备 EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；RE-52A真空旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DHP-9162智能型电热恒温培养箱（上海琅轩实验设备有限公司）；DHG-9123A电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；SHY-2A水浴恒温振荡器（常州国宇制造有限公司）；YJ-875型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；YXQ-LS-50S立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 秦艽不同溶剂提取物的制备 采用加热回流法，分别以无水乙醇、65%的乙醇及水为溶剂进行提取。具体过程如下：称取药材粗粉50 g，按料液比（1∶6）加溶剂，先浸泡20 min，再加热回流30 min，过滤，收集滤液，滤渣按料液比（1∶4）加溶剂，再加热回流30 min，过滤，合并两次滤液，在60℃以下减压浓缩回收溶剂，所得浸膏用水溶解并转移定容至50 ml容量瓶中，浓度相当于原药材1 g/ml，置于4℃冰箱，备用。

1.2.2 菌株的活化和菌悬液的制备 将低温保藏的粪肠球菌、表皮葡萄球菌、福氏志贺菌和金黄色葡萄球菌标准菌株接种于营养琼脂培养基上，37℃ 培养过夜，观察各菌株的生长情况并制片镜检有无杂菌污染。活化后的指示菌株接种到营养肉汤培养基中于摇床上 37℃ 恒温震荡培养 16 h，得到原菌液。通过比浊管比浊后，用无菌水稀释成浓度为0.5麦氏单位（1.5×106 cfu/ml）的菌悬液备用。

1.2.3 不同提取物的抑菌活性测定 采用牛津杯法进行体外抗菌活性试验。于营养琼脂培养基平板表面接种50 μl菌悬液并涂布均匀。并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，在水平放置的平皿中均匀地放置3只牛津杯。吸取一定浓度的抗菌药物溶液0.2 ml至牛津杯中，注意不要溢出牛津杯外。37℃培养16～24 h。观察结果，并用游标卡尺测量抑菌圈直径（mm）。平行进行3次试验，以3次结果相同为准，抑菌圈直径结果以3次的平均值进行计算。根据抑菌圈的大小，初步判断细菌对药物的敏感性。抑菌效果判定：抑菌圈直径>20 mm为极敏感，>15～20 mm為高度敏感，10～15 mm为中度敏感，抑菌圈<10 mm为低度敏感[12]，“-”为无抑菌活性。

1.2.4 最小抑菌浓度（MIC）测定 采用试管二倍稀释法联合琼脂平板法进行提取物MIC测定[13-15]。 取无菌试管10支，排成一排，除第一管外，其余每管加入营养肉汤0.5 ml，在第1管和第2管加入秦艽提取物原液0.5 ml并混匀，然后从第2管吸取0.5 ml加至第3管，混匀后再吸取0.5 ml加至第4管，如此连续倍比稀释至第9管，并从第9管中吸取0.5 ml弃去，第10管为不含药物的生长对照。最后在每管内加入上述稀释好的菌液各0.5 ml，使每管最终菌液浓度约为5×105 cfu/ml。第1管至第9管药物浓度分别为250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 mg/ml。另设阳性对照（试验菌株+营养肉汤）、阴性对照（营养肉汤）。置37℃培养箱培养18～24 h。由于中药液的色泽浑浊，需采用琼脂平板法观察结果（具体步骤参照文献[10]）。

2结果

2.1不同提取物对不同菌株的抑菌活性

从表1得知，以无水乙醇、65%乙醇和水为溶剂的秦艽提取物对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌均有不同程度的抑制作用。而对福氏志贺菌基本没有抑制作用。从不同提取溶剂看，65%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌极敏感，其抑菌圈直径达到25.1、27.6、34.2 mm，无水乙醇提取物对表皮葡萄球菌和粪肠球菌高度敏感，而水提取的抑菌效果比65%乙醇和无水乙醇提取物的抑菌效果弱一些。从不同提取液的浓度看，各个质量浓度秦艽提取物均对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌有抑菌作用，且药液浓度越高，抑菌效果越好，具有剂量依赖性。但其提取物抑菌机制有待进一步探讨。由于上述三种提取物对福氏志贺菌的基本没有抑菌活性，故以下MIC试验未选取福氏志贺菌作为受试菌株。

2.2不同提取物对不同菌株的最小抑菌浓度

由表2可以看出，秦艽65%乙醇提取物对表皮葡萄球菌和粪肠球菌的抑菌效果较好，其MIC为15.63、7.83 g/L。水提取物对表皮葡萄球菌和粪肠球菌的MIC相同，为31.25 g/L。无水乙醇提取物对粪肠球菌的MIC较低，与65%乙醇提取物相同。而三种提取物对金黄色葡萄球菌的MIC相对较高，为62.5 g/L以上。

3讨论

近年来，滥用抗生素导致细菌耐药性不断增强，抗生素耐药已经引起社会的高度重视。寻求绿色、无污染、耐药低的药物已迫在眉睫。植物提取物作为新兴抗菌药物，既不会使细菌产生耐药性也基本无残留，将其制成防腐剂、化妆品、保健品和药品具有良好的应用前景[16]。

本实验中秦艽醇提物对不同细菌均有抑菌活性，对易于感染人体引起败血症和心内膜炎尿路、腹腔、盆腔感染、烧伤后伤口感染等疾病的粪肠球菌和败血症，慢性前列腺炎等疾病的表皮葡萄球菌均有较好的抑制作用。其抑菌作用大小顺序为：65%乙醇提取物>无水乙醇提取物>水提取物。该结果为秦艽药材的抗菌效用提供了实验依据，为合理使用秦艽药材奠定了基础。

由于不同提取溶剂极性不同，提取的各种成分有差异以及细菌自身生长所需环境要素及代谢方式的不同，不同溶剂提取物抑菌活性强弱也不尽相同[17]。在中药提取物的抑菌实验中，通常醇提物的药理活性强于水提物，主要是由于不同浓度乙醇提取中药成分能对化合物极性进行筛选，化学成分极性的差异导致药理学作用效果不同[18]。本实验结果与赵兵等[11]报道一致，秦艽药材醇提部分的抑菌作用大于水提部分，说明其抑菌成分主要存在于醇提物中。秦艽主要成分是醇提物部分的环烯醚萜苷类，说明其与抗菌作用有一定关系，该研究也为下一步对其不同化学成分的抑菌能力考察提供参考依据。

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（收稿日期：2017-07-05 本文编辑：许俊琴）

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