防治红枣黑斑病的杀菌剂筛选和复配研究

材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试药剂

供试的14种杀菌剂均由中国农业大学植物病理学系种子病理与杀菌剂药理学研究室提供（表1）。

1.1.2 靶标病菌

引起红枣黑斑病的细极链格孢A.tenuissima菌株由塔里木大学植物科学学院提供。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖18 g，琼脂粉14 g，去离子水1 L。

水琼脂：琼脂粉10 g，去离子水1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化

将供试菌株接种在PDA平板上，28℃黑暗培养5 d后备用。

1.2.2 杀菌剂对A.tenuissima菌丝生长的影响

采用中华人民共和国农业行业标准 （NY/T1156.2-2006）中的平皿菌丝生长抑制法进行试验[16]。供试杀菌剂均以二甲基亚砜为溶剂配制为1 000 μg/mL的母液，再依次稀释为100、10、1、0.5、0.1、0.01和0.001 μg/mL 7个浓度，制成含药PDA平板。以添加等体积的溶剂和蒸馏水作为溶剂和空白对照。用直径5 mm的打孔器在靠近菌落边缘的同一圆周上打取菌饼并接种到不同浓度的含药PDA平板中央，每浓度3次重复。28℃黑暗培养5 d，采用十字交叉法测定菌落直径，计算相对抑制率。

相对抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%;

以设定浓度的对数为横坐标（x），抑制率几率值为纵坐标（y），求出各药剂对供试病菌的毒力回归曲线方程y=ax+b、决定系数R2以及有效抑制中浓度（EC50）。最后根据EC50，分析比较不同杀菌剂对供试病菌菌丝生长的影响。

1.2.3 杀菌剂对A.tenuissima孢子萌发的影响

将5 mm的A.tenuissima菌饼菌丝面朝下接种到PDA平板中央，28℃黑暗培養8 d，待菌丝铺满整个平板后加入10 mL无菌水洗脱孢子，用4层纱布过滤获得孢子悬浮液。加入无菌水制备成浓度为1×106个/mL的分生孢子悬浮液[17]。吸取150 μL分生孢子悬浮液均匀涂布在含不同浓度药剂的水琼脂平板上，25℃黑暗培养6 h后镜检（放大倍数10×10），每浓度3次重复，每次重复调查100个分生孢子。孢子萌发的标准为芽管长超过孢子长度的一半[18]。计算杀菌剂对红枣黑斑病菌分生孢子萌发的抑制率。

孢子萌发率=（萌发孢子数/孢子总数）×100%;

相对抑制率=（对照组孢子萌发率-处理组孢子萌发率）/对照组孢子萌发率×100%。

1.2.4 杀菌剂复配设计

根据供试杀菌剂单剂对菌丝生长和孢子萌发的EC50测定结果，最终选取吡唑醚菌酯和戊唑醇进行复配，评价药剂混用后的联合作用。将吡唑醚菌酯和戊唑醇按2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2等进行复配，测定复配剂对供试菌株菌丝生长和孢子萌发的EC50，同时按Wadley法计算增效系数（SR）。SR<0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR>1.5为增效作用[19]。

SR=EC50（理论）/EC50（实际）;

EC50（理论）=a+baEC（A）50+bEC（B）50。

a、b分别为相应单剂在复配剂中所占比例，A、B分别为吡唑醚菌酯和戊唑醇。

2 结果与分析

2.1 供试杀菌剂单剂对A.tenuissima菌丝生长的影响

药剂对A.tenuissima菌丝生长的影响如表2所示。咯菌腈和嘧菌环胺对菌丝生长的抑制效果最佳，其EC50分别为0.091 3和0.099 8 μg/mL;其次为异菌脲、咪鲜胺、己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鲜胺锰盐、氟硅唑和苯醚甲环唑，其EC50范围在0.268 8～0.515 6 μg/mL;丙环唑、啶酰菌胺、腐霉利、嘧菌酯和戊唑醇的EC50范围在1.188 8～3.256 1 μg/mL。

2.2 供试杀菌剂单剂对A.tenuissima孢子萌发的影响  供试药剂对A.tenuissima孢子萌发的影响如表3所示。其中，吡唑醚菌酯对孢子萌发的抑制效果最佳，EC50为0.015 3 μg/mL;其次为啶酰菌胺，EC50为0.293 4 μg/mL;嘧菌酯、异菌脲、咯菌腈和腐霉利的EC50范围在1.692 4～4.016 4 μg/mL;嘧菌环胺的EC50为19.134 μg/mL。7种细胞膜甾醇合成抑制剂在供试浓度下对A.tenuissima孢子萌发均没有抑制效果。

2.3 供试杀菌剂复配药剂对A.tenuissima菌丝生长的影响  吡唑醚菌酯和戊唑醇的不同配比组合对A.tenuissima菌丝生长的影响如表4所示。除吡唑醚菌酯∶戊唑醇=5∶5（w/w，下同）表现出拮抗作用外，其余6种配比均表现出相加作用。其中吡唑醚菌酯∶戊唑醇=8∶2时增效最明显，其SR值为1.124 5;其次为3∶7和2∶8的配比组合，其SR值分别为0.916 9和0.818 4;吡唑醚菌酯和戊唑醇的配比为6∶4、7∶3和4∶6时相加作用不显著。

2.4 供试杀菌剂复配药剂对A.tenuissima孢子萌发的影响  吡唑醚菌酯和戊唑醇的不同配比组合对A.tenuissima孢子萌发的影响如表5所示，其中吡唑醚菌酯：戊唑醇=5∶5时相加作用最为明显（SR值=1.164 6），3∶7、2∶8、6∶4和4∶6 4个配比也表现为相加作用，其SR值分别为0.901 0、0.798 3、0.720 2和0.520 6，而8∶2和7∶3表现为拮抗作用。

3 结论与讨论

本研究选用14种杀菌剂单剂对A.tenuissima进行了菌丝生长和孢子萌发抑制试验，结果表明咯菌腈、嘧菌环胺、异菌脲、咪鲜胺、己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鲜胺锰盐、氟硅唑和苯醚甲环唑等9种药剂对A.tenuissima菌丝生长有抑制活性;吡唑醚菌酯和啶酰菌胺对病原菌孢子萌发有抑制效果;以三唑类为代表的麦角甾醇生物抑制剂对病原菌孢子萌发均没有明显的抑制效果，这与麦角甾醇生物合成抑制剂的作用机理相关，有研究认为麦角甾醇生物抑制剂对菌丝生长有显著影响，但不影响孢子萌发[20]。这与本研究结果一致。

吡唑醚菌酯的作用机理是阻止呼吸作用复合物Ⅲ中细胞色素b和c1之间的电子传递，使线粒体无法为细胞提供能量而导致其死亡，达到杀死病原菌的目的。吡唑醚菌酯能抑制病原菌菌丝生长也能抑制孢子萌发，具有治疗、保护、铲除、强内吸性及耐雨水冲刷等特性[21-22]，已被用于许多真菌病害的防治，且在大豆[23]、玉米[24]及棉花[25]等作物上的保健、增产和促生作用被不断证明;戊唑醇是1986年德国拜耳公司开发的一种高效、广谱、低毒的三唑类杀菌剂，其作用机理是抑制真菌细胞壁中麦角甾醇中间体的氧化脱甲基反应从而抑制病原菌生长[26]，具有保护、治疗、铲除及持效期长等特性。

吡唑醚菌酯和戊唑醇均为高效、广谱、低毒的杀菌剂，且作用类型不同。本文选择这两种药剂进行复配，研究其单剂和复配剂对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响，采用Wadley法计算复配药剂的增效系数，最终获得了对A.tenuissima菌丝生长和孢子萌发抑制均表现出相加作用最优复配组合。

红枣黑斑病是近年来流行在新疆红枣产区的主要病害之一，对红枣的生产和品质造成了严重的影响，多种杀菌剂交替使用或运用复配药剂可以缓解由于长期施用单一杀菌剂产生的抗药性问题，延长杀菌剂的使用寿命。另一方面，戊唑醇的价格远低于吡唑醚菌酯，二者复配还能降低田间用药成本。本研究为红枣黑斑病的科学用药提供了理论支持。但在自然条件下，由于气候、施药时期和方式、药剂与病原菌的接触程度等因素，室内毒力测定试验的结果往往与田间试验获得的结果有一定偏差。因此，本研究筛选出的单剂和混剂配比还需田间试验进一步验证。

参考文献

[1] 池振江.适于新疆红枣主要病虫害防治的生物农药筛选及应用[D].石河子：石河子大学，2014.

[2] SUN Liang，JIANG Juan.Effect of jujube extract on oxidative injury in heart muscles of exhausted training rats [J].African Journal of Microbiology Research，2011，5（14）：1896-1899.

[3] 国家统计局.红枣产量分省年度数据[DB/OL].2016.http：∥data.stats.gov.cn/easyquery.htm？cn-E0103.

[4] 王兰，冯宏祖，支金虎，等.32.5%苯甲·嘧菌酯悬浮剂对枣黑斑病的室内毒力测定与田间防效试验[J].江苏农业科学，2013，41（1）：134-135.

[5] 符泽.新疆阿拉尔垦区矮化密植枣园红枣黑斑病发病规律的初步研究[D].石河子：石河子大学，2015.

[6] 李夏鸣，郭黄萍，胡增丽.枣黑斑病研究[J].山西农业科学，2009（11）：37-40.

[7] 董宁.枣黑斑病症状表现、病菌分析及室内药剂筛选[D].阿拉尔：塔里木大学，2015.

[8] RAJA P，REDDY A V R，ALLAM U S.First report of Alternaria tenuissima causing leaf spot and fruit rot on eggplant （Solanum melongena） in India[J].Plant Pathology，2006，55（4）：579.

[9] BAGHERABADI S，ZAFARI D，SOLEIMANI M J.First Report of leaf spot of strawberry caused by Alternaria tenuissima in Iran [J]. Journal of Plant Pathology & Microbiology， 2015， 6（3）：258.

[10] 許伟民，谢昀烨，王春伟，等.北五味子黑斑病的药剂防治[J].吉林农业大学学报，2013（5）：520-529.

[11] 郑晓莲，赵光耀，茆正川，等.枣缩果病病原诊断初报[J].植物保护，1995，32（2）：19-21.

[12] 郑晓莲，齐秋锁，赵光耀，等.枣缩果病初侵染来源的初步研究[J].河北农业大学学报，1995，18（4）：59-63.[13] TAN C ˇINOV D，MAKOV Z，RYBRIK L，et al.，Colonization of grapes berries by Alternaria sp.and their ability to produce mycotoxins [J].Potravinarstvo，2016，10（1）：7-13.

[14] 蔡龙.红枣黑斑病发病研究及药剂防治试验[J].山西果树，2013（3）：3-5.

[15] Fungicide Resistance Action Committee.Fungicides sorted by mode of action （including FRAC Code numbering）[J/OL].[2018-2].http：∥www.frac.info/publications/downloads.

[16] 农业部农药检定所.NY/T1156.2-2006，抑制病原真菌菌丝生长试验平皿法[S].北京：中国农业出版社，2006：1-2.

[17] 陈凤平，韩平，张真真，等.啶菌噁唑对番茄灰霉病菌的抑菌作用研究[J].农药学学报，2010（1）：42-48.

[18] 古丽皮艳，韩青梅，王兰.不同杀菌剂对玉米弯孢叶斑菌的毒力测定[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2005，33（S1）：49-52.

[19] 耿忠义，赵京岚，孙国波，等.腈菌唑与甲基硫菌灵对苹果轮纹病等3种病菌混配增效作用研究[J].中国农学通报，2010（18）：297-300.

[20] SIEGEL M R.Sterol-inhibiting fungicides：effects on sterol biosynthesis and sites of action [J].Plant Disease，1981，65（12）：986-989.

[21] BAYLIS A.Agrochemicals coming off-patent 2012-2016 [R].London：Informa UK Ltd，2011：68-70.

[22] 杨丽娟，柏亚罗.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂—吡唑醚菌酯[J].现代农药，2012（4）：46-50.

[23] 陈雨，张爱芳，夏本勇，等.吡唑醚菌酯对大豆炭疽病防效及保健增产作用[J].农药，2011（9）：697-699.

[24] 于晓丽，王培松，巴信斌，等.17.2%吡唑醚菌酯·氟环唑悬乳剂对玉米的防病保健作用[J].安徽农业科学，2015（25）：92-95.

[25] 陈雨，张爱芳，於春，等.吡唑醚菌酯对棉花炭疽病的防效及保健增产作用[J].中国棉花，2011（6）：24-26.

[26] 华乃震.杀菌剂戊唑醇的剂型与应用[J].农药，2013，52（11）：781-786.

（责任编辑： 杨明丽）

推荐访问:黑斑病 杀菌剂 红枣 筛选 防治