热研7—33—97袋装苗叶片愈伤组织诱导培养研究
摘 要 为扩大橡胶树组织培养外植体来源和建立高效稳定的橡胶树叶片离体再生体系，以1年生巴西橡胶树品种热研7-33-97袋装苗叶片为材料，研究叶片的预处理、0.1%升汞不同消毒时间、离体叶片切取部位、3种激素（6-BA、NAA、2，4-D）不同浓度配比对愈伤组织诱导的影响，筛选愈伤组织诱导最适培养基。结果表明：用液体培养基MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA对橡胶树袋装苗叶片进行预处理，可诱导出愈伤组织；用0.1%升汞对袋装苗叶片消毒15 min，其存活率达2.47%，为最佳消毒方法；用含主脉叶块和含主脉出愈叶块未出愈伤组织部分进行培养所诱导的愈伤组织质地较坚实、呈黄绿色，为橡胶袋装苗叶片培养的最适宜外植体；橡胶袋装苗叶片最佳愈伤组织诱导培养基是MS+ 3 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L 2，4-D + 0.2 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝胶，用此培养基对含主脉叶块和含主脉出愈叶块未出愈伤组织部分进行培养，其出愈率分别达49.07%和42.22%。结论：大田1年生橡胶树品种热研7-33-97袋装苗叶片经预处理后选择含主脉叶块为外植体，可诱导出理想的愈伤组织。
关键词 热研7-33-97；袋装苗；叶片；愈伤组织
中图分类号 Q813.12 文献标识码 A
Callus Culture From Bagged Seedlings Leaves of
Hevea Brasiliensis Müll. Arg. Clone Reyan 7-33-97
OUYANG Chao1，MO Tinghui1*，ZENG Lixing2
1 College of Agronomy，Hainan University，Haikou 570228，China
2 College of Environmental Sciences and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China
Abstract In order to expand the rubber tree explant sources and to establish efficient and stable rubber tree leaves in vitro regeneration system，the annual bagged seedling leaves of Reyan 7-33-97 were used as the explants to study on the effects of leaves pretreatment，different disinfection time with 0.1% HgCl2，different parts of detached leaves，different combinations of three kinds of phytohormone（6-BA， NAA， 2，4-D）on callus induction frequency，and screen the best subculture medium. The results showed that leaves pretreated with liquid medium MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA could induce callus；leaves disinfected with 0.1% HgCl2 for 15 min was the best disinfection method，its survival ratio could be 2.47%；leaves（with principal vein） and no callus part of leaves（with principal vein）already produced callus were the most suitable explants for rubber bagged seedlings leaves，callus induced by which showed tighten and yellow-green；the optimum callus induction medium was MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4% sucrose+3 g/L phytagel，leaves（with principal vein）and no callus part of leaves（with principal vein）have already produced callus were cultured in this medium，their callus inducing ratio can amount to 49.07% and 42.22%. Conclusion：after pretreatment，choose leaves（with principal vein） of annual bagged seedling leaves of Reyan 7-33-97 as explants that can be used to induce ideal callus.
Key words Reyan 7-33-97；Bagged seedlings；Leaves；Callus
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.014
为了拓宽巴西橡胶树选育种途径，从20 世纪50年代以来，橡胶育种学家们开始着手研究其组织培养技术，特别是20 世纪70 年代以后，中国、马来西亚、法国、印度、印度尼西亚、斯里兰卡等国投入大量的人力、物力、财力对这项技术进行广泛的研究[1]。橡胶树组织培养的最初外植体主要是花药和内珠被，至今，王泽云等[2]利用巴西橡胶树（Hevea Brasiliensis Müll. Arg.）“海垦2”、“热研88一13”、“PB86”等无性系品种的花药进行培养，诱导出高出愈率愈伤组织、胚状体及完整植株。但花药培养受开花季节限制，而且花药较小，剥离困难。Carron等[3]利用巴西橡胶树“PB260”、“PB 235”和“PR107”等品种内珠被诱导出紧实愈伤组织并建立再生体系，到目前为止已取得了较大进展，其胚性愈伤诱导率达到60%～100%，由体细胞胚诱导出再生植株的频率达到30%。周权男等[4]以橡胶树6～10周幼果胚珠内的内珠被及珠心为外植体进行培养，建立了内珠被再生体系，待花季过后还可以取内珠被作外植体，延长了获取外植体的时间。于波等[5]以橡胶树试管苗无菌幼根作外植体，经体细胞胚发生途径诱导了再生植株。橡胶树其他外植体的组织培养，如利用未授粉胚珠及子房[6]均成功诱导出再生植株，但植株的诱导率和植株移栽成活率均较低。以橡胶树叶片为外植体进行组织培养研究的报道不多，印度橡胶研究所通过叶片培养已得到再生植株，其次生体细胞胚发生和转基因研究也已取得一定进展[7-8]；孙爱花等[9]以橡胶树品种热研7-33-97无菌苗为材料，采用不同激素及其浓度配比，诱导出无菌苗叶片愈伤组织。但以巴西橡胶树袋装苗叶片为外植体进行愈伤组织诱导的研究还未见报道。本研究利用海南橡胶大规模推广品种热研7-33-97袋装苗叶片为实验材料，研究叶片不同预处理、0.1%升汞不同时间消毒、离体叶片切取部位、3种激素（6-BA、NAA、2，4-D）不同浓度配比对愈伤组织诱导的影响，筛选出愈伤组织诱导最适培养基，为成功诱导该品种的体细胞胚、继而培养成小植株奠定基础，更为橡胶树其他品种、类型及其他植物的组织培养研究提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验材料为1年生巴西橡胶（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）优良品种热研7-33-97袋装幼苗，由中国热带农业科学院生物技术研究所陈雄庭研究员馈赠。
1.2 方法
1.2.1 外植体的消毒 （1）早上7：00～8：00采取淡绿期（变色期）大概长10 ㎝的嫩叶，置冰上带回实验室，先用约5%洗衣粉液浸泡10 min，再用流水冲洗叶片1 h；（2）将叶片置于无菌操作台，以主脉为中心，纵切叶片，分成3部分，一部分为含主脉叶块，另外2部分为不含主脉叶块，切成大小约2 cm×4 cm的小叶块； （3）用0.1%升汞分别消毒10、15、20、25 min，无菌水冲洗3次，在无菌操作台上将其切成0.8 cm×0.6 cm的小叶块；（4）接种到MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+7%蔗糖+2.2 g/L phytagel[9]的启动培养基上，而后将其置于（25±2）℃培养室中进行暗培养。每种消毒时间分别接种27片小叶块，3次重复，6周后观察小叶块在培养基上的生长情况，并统计外植体的污染率、死亡率和存活率，以存活率最高的消毒时间为叶片的最佳消毒时间。
污染率=（污染的叶块数/接种叶块数）×100%
死亡率=（死亡的叶块数/接种叶块数）×100%
存活率=（存活的叶块数/接种叶块数）×100%
1.2.2 预处理所需培养基配方筛选 （1）以MS为基本培养基，激素处理利用L9（34）正交表，将2， 4-D浓度设0、0.5、1.0 mg/L 3个梯度，6-BA设1.0、2.0、3.0 mg/L 3个梯度，NAA设0.2、0.5、1.0 mg/L 3个梯度，共同组合成9个处理（表1），分别加入3.0 g/L植物凝胶和4%蔗糖并调节pH至5.8，经高温高压灭菌后备用； （2）采集淡绿期叶片后，将叶片按上述所确定的最佳消毒时间进行消毒并按1.2.1同样的叶片切取方式将叶片切成小叶块，分别置于这9个处理的培养基上，每个处理72块（其中36块含主脉叶块、另外36块不含主脉叶块），3次重复，接种后置于（25±2）℃培养室进行暗培养；（3）6周后，观察接种叶块形态（如皱卷、隆起、叶脉膨大及愈伤组织形成情况等），计算接种叶块形态改变百分率并进行统计学分析。以叶块形态改变百分率最高的液体培养基对袋装苗叶片进行预处理。
叶块形态改变百分率=（叶块形态改变的叶片数/总接种叶块数）×100%
1.2.3 叶片的预处理 （1）配制上述叶块形态改变百分率最高的液体培养基，不加蔗糖，调节pH至 5.8，并经过高压灭菌后备用： （2）在袋装苗叶片古铜期，用渗透性较好的一层薄纸包裹住叶片，然后用滴管吸取上述液体培养基滴于薄纸上至完全浸润为止（图1-A）。每天早上7：00和傍晚7：00各处理一次，待叶片长至淡绿期，采样放置冰上，取回备用。
1.2.4 愈伤组织诱导培养基筛选 （1）将上述采回的叶片进行浸泡、流水冲洗（方法同1.2.1），按1.2.1确定的最佳升汞消毒时间对叶块进行消毒，用无菌水冲洗3次： （2）接种方法同1.2.2，即在无菌操作台上将其切成0.8 cm×0.6 cm小叶块，分别接种到含不同浓度激素配比的培养基上（配方设计见表1），每个处理72块（其中36块含主脉叶块、另外36块不含主脉叶块），3次重复。叶片接种后置于（25±2）℃培养室进行暗培养； （3）6周后，统计出愈率，以出愈率最高的培养基为叶片愈伤组织诱导最优培养基，同时分别统计不含主脉叶块及含主脉叶块的出愈率。
出愈率=（出现愈伤组织的叶块数/接种叶块数）×100%
不含主脉叶块出愈率=（不含主脉叶块出现愈伤组织的叶块数/接种不含主脉叶块数）×100%
含主脉叶块出愈率=（含主脉叶块出现愈伤组织的叶块数/接种含主脉叶块数）×100%
1.2.5 含主脉出愈叶块未出愈伤组织部分再诱导 将含主脉出愈叶块置于无菌操作台上，分别切出愈伤组织部分和非愈伤组织部分，将愈伤组织部分置于上述愈伤组织最佳诱导培养基上继续培养，取非愈伤组织部分叶块（0.4 cm～0.6 cm）×（0.2 cm～0.4 cm）大小进行再诱导培养。再诱导培养基选用3种培养基进行筛选，第一种培养基配方为上述出愈率最高的培养基x1=MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝胶；第二种培养基为x2=MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝胶；第三种培养基为x3=MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝胶。每种培养基接15个非愈伤组织部分叶块进行再诱导，3次重复。6周后，观察并记录再诱导愈伤组织块及褐化愈伤组织块情况，计算每种培养基再诱导愈伤组织出愈率和褐化率，以再诱导愈伤组织出愈率最高的培养基为出愈叶块未出愈伤组织部分再诱导最优培养基。
再诱导叶块愈伤组织率=（再诱导出愈伤组织块数/接种再诱导叶块数）×100%
再诱导叶块褐化率=（再诱导褐化的叶块数/接种再诱导叶块数）×100%
1.2.6 数据处理分析 实验处理均采用 SPSS18.0 进行方差分析和多重比较（Duncan法）；用Microsoft Office Excel 2007 进行数据处理和图表绘制。
2 结果与分析
2.1 不同消毒时间的消毒效果
升汞同一浓度不同消毒时间影响外植体消毒效果。在污染率、死亡率和存活率3个指标上，0.1%升汞不同消毒时间的差异均达到显著水平（p<0.05），其污染率为7.41%～79.01%，消毒10 min污染率最高，达79.01%，显著高于其他处理；消毒25 min污染率最低，为7.41%，显著低于其他处理。不同消毒时间的死亡率为20.99%～92.59%，其中消毒25 min死亡率最高，达92.59%，显著高于其他处理；消毒10 min死亡率最低，为20.99%，显著低于其他处理。升汞不同消毒时间其存活率为0～2.47%，消毒15 min存活率最高，达2.47%，其他3个处理存活率均为0%（表2）。综合考虑污染率、死亡率及存活率，橡胶树袋装苗叶片最佳消毒方法为0.1%升汞消毒15 min。
2.2 叶片预处理所需培养基
在筛选升汞消毒时间时，接种叶块在启动培养基上培养均未见形态的改变（如皱卷、隆起、叶脉膨大及形成愈伤组织等），重新设计培养基对叶块进行培养。
从试验结果可看出，9个处理之间差异均达到显著水平（p<0.05）。接种6周后，除处理1外，其他处理均出现不同程度的叶块形态改变（出现皱卷、隆起、叶脉膨大等现象），其叶块形态改变百分率为4.17%～15.28%，其中叶块形态改变率最高为处理8，达15.28%，显著高于其他8个处理（表3）。以上9个处理均未出现愈伤组织。故按处理8配成液体培养基（即MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA）对袋装苗叶片进行预处理。
2.3 叶片愈伤组织诱导培养基
经过预处理的叶片，分别接种在按表1设计的9种培养基中，暗培养2周后，叶块陆续开始皱卷、隆起，叶脉慢慢变白（图1-B、C）；培养至第4周后，叶脉膨大处产生黄绿色、表面湿润的愈伤组织，一些叶块的边缘也有淡黄色的愈伤组织产生（图1-E、F）；第6周后，愈伤组织面积慢慢扩大，此时的愈伤组织质地紧密，呈半透明状（图1-H）。
各处理的出愈率见表4。由表4可看出，经预处理的叶片在9种培养基中均可诱导出愈伤组织，其出愈率为5.56%～31.94%。其中出愈率最低的为处理1和处理7，均为5.56%，显著低于处理4、处理5及处理8，与其他处理差异不显著；出愈率最高的为处理8，达31.94%，显著高于其他处理。
综合分析表3和表4可知，在相同的培养基和培养条件下，未经预处理与经过预处理的橡胶袋装苗叶片愈伤组织诱导效果不同。未经预处理的叶片经培养后，仅出现皱卷、隆起、叶脉膨大等叶块形态的改变，但均未出现愈伤组织；而经预处理的叶片培养后均出现愈伤组织。说明橡胶树袋装苗叶片经预处理可以诱导产生愈伤组织。
2.4 不含主脉叶块及含主脉叶块对愈伤组织诱导的影响
一般而言，激素组合、浓度配比、外植体取材部位等不同，都会影响愈伤组织形成及生长。本研究将经预处理的含主脉叶块和不含主脉叶块分别接种在9种培养基中培养，它们的出愈率不同（表5）。由表5可知，经预处理的含主脉叶块及不含主脉叶块均出现愈伤组织。不含主脉叶块出愈率为1.85%～14.81%，其中出愈率最低的为处理1和处理7，为1.85%，显著低于处理8，与其他处理差异不显著；出愈率最高的为处理8，达14.81%，显著高于其他8个处理；含主脉叶块出愈率为9.26%～49.07%，其中出愈率最低的是处理1和处理7，为9.26%，显著低于处理4、5、8，与其他处理差异不显著；出愈率最高的为处理8，达49.07%，显著高于其他处理。比较含主脉叶块和不含主脉叶块在同一培养基上的出愈率可以看出，含主脉叶块出愈率高于不含主脉叶块出愈率。
在诱导愈伤组织过程中，观察含主脉叶块与不含主脉叶块形成愈伤组织的时间不同。含主脉叶块培养4周后长成直径为5～6 mm的愈伤组织，其愈伤组织长出部位有的分布在主脉尖端，有的覆盖整个叶块主脉，有的分布在叶边缘，此时的愈伤组织质地较坚实、呈黄绿色（图1-E、F）。不含主脉叶块要在培养5周后才长出愈伤组织，且分布在叶片边缘，此时的愈伤组织松软，呈黄白色，平滑（图1-D）。6周后，不含主脉叶片诱导出的愈伤组织色泽淡黄、质地松散、水渍化（图1-G），不宜继续培养，弃用；而含主脉叶块诱导出的愈伤组织直径为11～12 mm（图1-H），边缘出现褐化现象，需转瓶培养。
2.5 含主脉出愈叶块未出愈伤组织部分再诱导培养基筛选
将含主脉出愈叶块未出愈伤组织部分叶块取（0.4 cm～0.6 cm）×（0.2 cm～0.4 cm）大小分别接入3种培养基中（x1、x2、x3）进行再诱导愈伤组织培养。经再诱导培养6周后，再诱导愈伤率及褐化率如图2所示。由图2可看出，3种培养基中，再诱导愈伤组织率最高为x1培养基，达42.22%，显著高于其他2种培养基；其次为x2培养基，其再诱导愈伤组织率为11.11%；x3培养基上并未诱导出愈伤组织。从褐化率看，x1培养基褐化率最低，为53.33%，显著低于其他2种培养基；其次为x2培养基，其再诱导褐化率为80%；在x3培养基上生长的叶块，褐化率最高，达91.11%。综合考虑再诱导愈伤组织率及褐化率，出愈叶块未出愈伤组织部分最佳再诱导愈伤组织培养基为x1培养基。
3 讨论
叶片的预处理可以提高植物叶片组织培养的成功率。黄磊等[10]对蝴蝶兰叶片研究发现，创伤和高渗透压预处理可以显著提高外植体的类原球茎诱导效率；罗丽华等[11]研究了暗处理、萎蔫处理和预先质壁分离3种不同预处理对人心果叶片原生质体产量的影响，结果表明3种处理均对原生质体产量增加有促进作用。本研究采用液体培养基对橡胶树品种热研7-33-97袋装苗叶片进行预处理，可有效诱导叶片愈伤组织的产生，在橡胶树袋装苗叶片愈伤组织诱导的报道中尚属首次。初步推测是液体培养基使叶片从古铜期到淡绿期逐渐适应离体培养环境，使得接种以后叶块较快地启动脱分化，最终形成愈伤组织，但其作用机制有待进一步研究。
在植物组织培养过程中，消毒既是必要也是关键步骤。据报道，王丽萍等[12]发现采用75%酒精-15%次氯酸钠5 min-0.1%升汞17 min的消毒剂组合对番木瓜消毒效果较好；汪腾越等[13]采用土沉香茎段为外植体，用洗衣粉水清洗外植体10 min，流水冲洗 30 min，而后在超净工作台中，用75%的酒精浸泡30 s，无菌水涮洗1次，0.1%升汞消毒5 min，无菌水涮洗3次，相比10%次氯酸钠消毒5 min而言，此为最优消毒方式。本研究采用0.1%升汞对橡胶树袋装苗淡绿期叶片消毒15 min，简化消毒过程，同样达到较好的消毒效果。
有关植物叶片愈伤组织起始发生的部位已有一些报道。彭海峰等[14]对仙茅叶片（8 cm长幼叶）组织培养的细胞学观察表明，其愈伤组织起始于中脉维管束与上表皮之间的薄壁细胞，认为对于仙茅叶片的组织培养，取材时应选取长度不超过8 cm的幼叶，并切取带有中脉的叶块，以提高仙茅的离体成苗率。暨淑仪等[15]在对茶叶片（芽下第1、2片叶）愈伤形成的组织细胞学观察中发现，叶肉中的小叶脉周围以及主脉中的薄壁细胞首先启动脱分化， 分裂形成分生细胞团， 继而形成愈伤组织。本研究对叶片进行了分部位培养，结果发现，含主脉叶块比不含主脉叶块出愈率高。下一步工作将用更为具体的细胞学观察来探讨橡胶叶片愈伤组织的起源和形成过程。
尽管植物激素可调控多数物种器官的发生，但由于在不同组织中这些激素的内在水平不同，因而对某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同[16]。不同植物叶片愈伤组织诱导率因所附加的植物生长调节剂的种类、浓度配比和组合的不同而不同。杨凤玲等[17]对枇杷叶片进行愈伤组织诱导，附加1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L 2，4-D，并认为多数植物离体培养诱导脱分化都必须添加2，4-D，这是诱导愈伤组织和细胞悬浮培养最有效的激素之一。沈周高等[18]在对3个杨树品种叶片进行再生体系的建立过程中发现，愈伤组织最佳诱导效果与NAA/6-BA 比值有一定的相关性。印度橡胶研究所Kala等[8]通过添加0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.2 mg/L 2，4-D 3种激素的组合诱导出叶片愈伤组织；孙爱花等[9]以热研7-33-97无菌苗叶片为外植体材料，通过添加1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，诱导其愈伤组织的产生，其诱导率达到26.7%。本研究以热研7-33-97袋装幼苗叶片为材料，通过添加3.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA，成功诱导出愈伤组织，这在国内尚属首例。
本研究以橡胶树品种热研7-33-97袋装苗为材料，从古铜期开始用液体培养基MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA对叶片进行预处理直至淡绿期，用0.1%升汞对淡绿期叶片消毒15 min，分别切取含主脉叶块和含主脉出愈叶块未出愈伤组织部分至培养基（MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝胶）中培养，均可诱导出愈伤组织。
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责任编辑：林海妹