基于线粒体COⅠ基因序列分析5个巨魾群体的遗传多样性

材料，采用基因克隆方法获得线粒体CO Ⅰ基因全序列进行分析，构建系统进化树，探讨不同巨群体的遗传和进化关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用2013年10月至2017年6月采自中国云南临沧市澜沧江上游（L）、西双版纳傣族自治州景洪市（J）、红河曼耗江段（M）、怒江傈僳族自治州怒江坝大桥（B）以及怒江傈僳族自治州三江口怒江下游（N）的巨各12尾，依次编号为 1～12，取其背部肌肉组织放入1.5 mL EP管中并浸入无水乙醇，做好标记置于冰箱-20 ℃保存。

1.2 试验方法

采用酚-氯仿方法[13]提取巨基因组DNA，1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测后经凝胶成像系统进行拍照并保存在 -20 ℃ 冰箱。巨PCR扩增所用的引物为杜民等[17]设计合成的1对简并引物，其名称和序列分别为Baya09F：5′-GAGTGAAAAYCTCCTAGTCYCT-3′，Baya09F：5′-GTTTCTCATTTAATWGAKCCTCC-3′，经过琼脂糖凝胶检测的目的PCR产物利用凝胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司）回收、纯化、连接转化后，利用通用M13引物进行菌液PCR后将筛选后的阳性克隆样品送至上海生物工程有限公司进行测序。

1.3 数据处理

测序结果利用DNAMAN 5.2.2软件进行比对，采用DnaSP 5.10.01软件分析核苷酸序列，采用MEGA 5.0软件对序列的碱基含量、转换和颠换比分析并构建系统进化树。

2 试验结果

对测序的结果用DNAMAN 5.2.2软件对60个巨的核苷酸序列进行比对并用DNAsp[18]软件比对后发现在5个群体60个样本序列共存在59个单倍型，其中怒江下游12个序列存在11个单倍型，其余4个群体的12个序列均发现12个单倍型;利用MEGA 5.0[19]软件中的Kimura双参数模型[20]分析5个巨群体之间的碱基转换/颠换（R）的范围在 0.691～31.798，5个群体之间碱基的平均转换/颠换比值范围为 2.864～9.096。60个体CO Ⅰ基因序列的全长为 1 551 bp，保守位点1 144个、变异位点428个、简约信息位点267个、单态突变位点160个。5个巨群体碱基组成百分比结果见表1。

利用MEGA 5.0软件中Kimura 2-parameter model参数对本研究5个群体60个巨CO Ⅰ基因核苷酸序列分别进行群体内和群体间的遗传距离分析，群体间平均遗传距离见表2，右上角为转换+颠换（Ts+Tv），群体间平均遗传距离左下角为转换/颠换（Ts/Tv）。

本研究选择斑马鱼（Danio rerio）作为外群，NCBI上面的登录号为NC_002333。 利用5个群体60尾巨和斑马鱼基于Kimura双参数模型建立的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）系统进化树见图1。

3 讨论

3.1 巨CO Ⅰ基因碱基组成

线粒体基因属母系遗传且稳定，线粒体CO Ⅰ基因既有足够的变异，又便于PCR扩增，使其成为DNA条形码基因之一[21-22]，利用其核苷酸序列的差异，可以进行物种鉴别、遗传及进化关系分析，被广泛应用于鸟类、鱼类、昆虫和动物的鉴别[23]。本研究采用基因克隆测序方法比较了云南省内3个河流5个不同群体（M-红河曼耗、N-怒江下游、B-怒江坝、L-澜沧江上游、J-景洪），各12尾巨共计60个样本的线粒体CO Ⅰ基因全长序列的碱基组成和单倍型进行分析。结果表明，巨线粒体CO Ⅰ基因核苷酸序列长度为 1 551 bp，其保守位点1 144个、变异位点428个、简约信息位点267个、单一突变位点160个。5个群体巨A+T的含量（55.5%）明显高于C+G的含量（44.5%），G含量（17.0%）最低，这与单云晶等的研究结果[14]一致。从原核生物到真核生物，其CO Ⅰ基因组中碱基A+T高的现象广泛存在，这一现象的产生与基因长度以及密码子反密码子间结合能力的大小有关[24]。

3.2 基于CO Ⅰ基因的不同巨群体的亲缘关系

5个群体中每12个个体中得到的单倍型除了怒江下游（N）群体为11个单倍型外，其余4个群体各得到12个单倍型，60个个体共得到59个单倍型，这可能是由于本试验利用的是CO Ⅰ基因的全长序列而不是特定的条形码所需的部分序列（648 bp）[22];5个群体的单倍型不存在共享的情况，表明5个巨鱼群体的遗传多样性较高。不同群体的单倍型个体在系统进化树上交织在一起，其中怒江坝（B）群体和怒江下游（N）交叉最为严重，这一结果与董新培等在日本沼虾群体中的研究结果[25]相一致。红河曼耗（M）群体和景洪（J）群体和另外其他3个不存在交叉情况，且红河曼耗（M）群体和景洪（J）群体的遗传距离较小。5个群体中怒江坝（B）群体和怒江下游（N）群体聚为一支、红河曼耗（M）和景洪（J）聚为一支;澜沧江上游（L）单独为一支并且靠近怒江坝（B）和怒江下游（N）的分支，这可能与其不同流域的基因交流有关系。巨是分布在东南亚的越南、柬埔寨、缅甸、印度及中国云南的元江（红河）、澜沧江和怒江的底栖性鱼类，由于味道鲜美而受到当地居民的喜爱，本研究中的巨1个群体来自红河的曼耗段（M），而红河最终经过中国的河口流向越南后最终到达北部湾，2个群体来自澜沧江的澜沧县段（L，澜沧江上游）和景洪段（J），而最终经过缅甸、老挝、泰国、柬埔寨、越南后进入南海，2个群体来自怒江的潞江坝段（B）和三江口段（N，怒江下游），怒江经由缅甸后流入印度洋;这样的地理状况为巨群体间的基因交流提供了可能性。怒江坝、景洪、澜沧江上游、曼耗、怒江下游同一群体内的遗传距离分别为4.629、4.000、2.697、3.427、6.718，以怒江下游群体内的遗传距离最大。遗传距离越大表明该群体内的遗传多样性越丰

富，本研究中怒江下游群体的遗传多样性最丰富、怒江坝群体次之、澜沧江上游群体的遗传多样性最小。遗传多样性的丰富程度表明了这个生物群体对于外界环境的适应能力，本研究的结果可为巨的遗传资源保护提供分子方面的依据。

参考文献：

[1]陈小勇. 云南鱼类名录[J]. 动物学研究，2013，34（4）：281-337.

[2]田树魁，薛晨江，冷 云，等. 巨的生物学特性初步研究[J]. 水生态学杂志，2009，30（3）：115-117.

[3]刘跃天，田树魁，冷 云，等. 野生巨生物学特性研究[J]. 现代农业科技，2010（18）：302-303，307.

[4]冷 云，田树魁，刘跃天，等. 巨食性初步研究[J]. 现代农业科技，2011（19）：329-330.

[5]薛晨江，张正雄，马建颜，等. 巨人工繁殖初报与胚胎发育观察[J]. 水生态学杂志，2012，33（5）：54-56.

[6]杜 民，牛宝珍，王婷婷，等. 巨细胞色素氧化酶基因多态性及系统进化研究[J]. 上海海洋大学学报，2016，25（3）：337-343.

[7]牛宝珍，杜 民，刘艳红，等. 巨线粒体DNA ND6基因克隆及多态性分析[J]. 江苏农业科学，2016，44（4）：62-65.

[8]杜 民，牛宝珍，贾梦应，等. 巨线粒体12S rRNA和16S rRNA基因克隆及多态性分析[J]. 西南大学学报（自然科学版），2017，39（5）：83-89.

[9]杜 民，牛宝珍，罗彩艳，等. 巨野生群体遗传多样性的RAPD分析[J]. 淡水渔业，2015，45（1）：15-19，24.

[10]肖武汉，张亚平. 鱼类线粒体DNA的遺传与进化[J]. 水生生物学报，2000，24（4）：384-391.

[11]Hebert P N，Cywinska A，Ball S L，et al. Biological identi-fications through DNA barcodes[J]. Proc Royal Soc London B：Biol Sci，2003，270（1512）：313-321.

[12]杜启艳，常重杰. DNA条形码在鉴定物种中的应用[J]. 生物学教学，2010，35（12）：60-61.

[13]单云晶，鲁翠云，李 超，等. 基于线粒体CO Ⅰ基因序列的5种鲤养殖品种遗传多样性研究[J]. 中国水产科学，2013，20（5）：931-938.

[14]曹 艳，章 群，宫亚运，等. 基于线粒体CO Ⅰ序列的中國沿海蓝点马鲛遗传多样性[J]. 海洋渔业，2015，37（6）：485-493.

[15]李 涛. 基于线粒体CO Ⅰ基因序列的雀科鸟类分子系统发育[D]. 西安：陕西师范大学，2008.

[16]郑兰平，陈小勇，杨君兴. 澜沧江中下游鱼类现状及保护[J]. 动物学研究，2013，34（6）：680-686.

[17]Du M，Niu B Z，Jia M Y，et al. The complete mitochondrial genome of the bagarius yarrelli from honghe river[J]. Earth and Environmental Science，2016，41：12-31.

[18]Librado P，Rozas J. DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics （Oxford，England），2009，25（11）：1451-1452.

[19]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA 4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA） software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2007，24：1596-1599.

[20]Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J]. Journal of Molecular Evolution，1980（16）：111-120.

[21]Fedorov A，Saxonov S，Gilbert W. Regularities of context-dependent codon bias in eukaryotic genes[J]. Nucleic Acids Research，2002，30（5）：1192-1197.

[22]Tautz D，Arctander P，Minelli A，et al. DNA points the way ahead in taxonomy[J]. Nature，2002，418（6897）：479.

[23]彭居俐，王绪桢，何舜平. DNA条形码技术的研究进展及其应用[J]. 水生生物学报，2008，32（6）：916-919.

[24]黄 原. 分子系统学——原理、方法和应用[M]. 北京：中国农业出版社，1998：70-76.

[25]董新培，武小斌，万海付，等. 河北3个日本沼虾野生群体线粒体DNA D-Loop基因序列变异及种群遗传结构分析[J]. 水产学报，2017，41（2）：182-188.

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