归肺理气方对痰热壅肺证慢性阻塞性肺疾病大鼠血清与肺组织MMP—9和TIMP—1的影响
材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与分组 SD大鼠61只，雄性，体重（240±20）g，购于中科院上海实验动物中心，合格证号SCXK（沪）2002-0010，饲养于上海中医药大学实验动物中心清洁级动物实验室。将大鼠随机分为7组（正常组、正常+中药中剂量组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、泼尼松组）。
1.1.2 受试药物 归肺理气方组成：鱼腥草9g、黄芩9g、炙麻黄9g、杏仁6g、葶苈子6g、前胡6g、紫苏6g、甘草6g。根据《中药药理研究方法学》[4]计算出中药低、中、高剂量组的人鼠等效剂量分别为2.12、4.25、8.50g/kg，即分别为人体
临床给药剂量的0.5、1.0、2.0倍。按传统工艺制备成水煎剂，减压浓缩至0.212、0.425及0.850g/mL备用。泼尼松片（上海信谊药业有限公司，批号：121106），研成粉末，加蒸馏水溶解，按6mg/kg灌胃。
1.1.3 仪器与试剂 动物熏吸箱（60cm×50cm×40cm），自制；18号静脉套管针（马来西亚制造）；脂多糖（LPS，Sigma公司）；大前门牌香烟（上海烟草公司，烤烟型，焦油量12mg，烟气烟碱量0.9mg，烟气一氧化碳量14mg）。MMP-9试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20120827），TIMP-1试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20120823）。DK-S22电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；P20、P200、P1000吉尔森移液器，法国Gilson公司；Centrifuge 5417R型低温高速离心机，德国Eppendorf公司。
1.2 方法
1.2.1 痰热壅肺证COPD大鼠模型的制作 根据相关文献[5]，采用气管注脂多糖加熏香烟方法：在第1天和第14天，予1%的戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于大鼠固定板，暴露声门，将18号静脉套管针快速插入气管，拔出针芯，用1mL注射器注入溶于生理盐水的LPS 200μL（1g/L），然后将大鼠固定板直立旋转，使LPS能够均匀分布于两肺。正常组注入生理盐水。第2～28天（第14天除外）将大鼠置入60cm×50cm×40cm熏吸箱内，注入大前门牌过滤嘴香烟烟雾，浓度约5%，每天上午、下午各1h。制作28d即为痰热壅肺证COPD大鼠模型。正常组注入生理盐水，不予熏烟。
1.2.2 给药干预与取材 造模完成后第2天开始，正常组与模型组给予饮用水，中药给药组给予不同浓度的归肺理气方，泼尼松组予泼尼松片粉末溶液，连续给药28d，在末次给药后处理动物。予3%戊巴比妥溶液麻醉大鼠，腹主动脉取血，处死大鼠后取出左肺组织。
1.2.3 指标测定 动脉血经5000r/min离心10min，分离出上层血清；称取肺组织，按100mg组织配伍1mL生理盐水的比例，加入生理盐水，制备组织匀浆，经5000r/min离心10min，取上清液检测；采用双抗体夹心ELISA法检测血清与肺组织中MMP-9和TIMP-1含量。
1.3 统计学方法
使用SPAA15.0软件进行统计，所有数据以（）表示，采用多组间单因素方差分析，组间两两比较用q检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血清MMP-9、TIMP-1含量与MMP-9/TIMP-1值比较
正常+中药中剂量组大鼠血清MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值较正常组无明显改变（P>0.05），模型组大鼠血清MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值较正常组显著增加（P<0.05），中药中、高剂量组与泼尼松组的MMP-9含量以及MMP-9/TIMP-1值较模型组显著下降（P<0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1含量与MMP-9/TIMP-1值比较
正常+中药中剂量组大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值较正常组无明显改变（P>0.05），模型组大鼠血清MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值较正常组显著增加（P<0.05），中药中剂量组的MMP-9含量以及MMP-9/TIMP-1值较模型组显著下降（P<0.05），中药高剂量组与泼尼松组的MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值较模型组显著下降（P<0.05）。见表2。
3 讨论
COPD发病机制至今尚未完全清楚。国外研究认为，COPD的发病机制可能包括3个方面：（1）气道和肺部炎症；（2）蛋白酶/抗蛋白酶失衡；（3）氧化/抗氧化失衡，并发现肺组织中弹性基质成分的降解可能是COPD发生、发展的主要原因[6]。
目前肺泡壁细胞外弹性基质破坏的详细机制尚未明确，大量研究表明，蛋白酶活性增强以及蛋白酶/抗蛋白酶的失衡是其主要发病因素[7-8]。
MMPs及TIMPs是调节细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解与合成的主要酶类，主要参与炎症反应和组织重建。MMPs是一类依赖于锌离子和钙离子，且高度保守的内切蛋白酶水解家族，是细胞外基质降解过程中不可缺少的酶，几乎能降解构成细胞外基质的所有成分[9]。MMPs在与支气管哮喘、肺癌的浸润和转移等多种肺部疾病及其他系统疾病（如膜性肾病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎等）关系密切[10]。
目前研究认为在MMPs家族中，MMP-9是COPD急性加重期起主要作用的酶[11]。Vognola等[12]在COPD急性加重期患者的血清和肺活检中均发现MMP-9的数量明显高于正常人。MMPs的活性严格受到内源性生理抑制物的调节，MMPs一经激活，就可被一族内源性金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）抑制。TIMPs是一个低分子量蛋白质家族，其中TIMP-1对MMP-9的抑制作用最广，可以被多种细胞因子诱导产生[13]。TIMP-1是气道重塑的重要因子，具有细胞生长因子样作用，能使ECM沉积并抑制其降解，是气道纤维化的标志，它与MMP-9共同参与了慢性阻塞性肺疾病患者肺组织的进行性破坏和相继发生的气道重塑过程[14]。
TIMP-1与MMP-9共分泌，机体正常时，与MMP-9呈1∶1结合，使ECM破坏及修复维持平衡。MMP-9/TIMP-1的平衡是维持ECM正常状态所必须的，一旦平衡打破则出现病理状态，MMP-9/TIMP-1比值升高，表明呼吸道以炎症反应为主，将引起组织破坏，MMP-9/TIMP-1比值下降，表面呼吸道以修复为主，过度降低（尤其是TIMP-1过度升高时）将出现纤维化可能[15]。
据报道，COPD急性加重期和COPD患者的痰中MMP-9/TIMP-1比值较健康人有显著升高，提示此时的MMP-9增多更为明显[16]。国外研究显示，COPD急性加重期患者血清MMP-9、TIMP-1异常过度表达，表明ECM降解及合成均异常活跃，TIMP-1在抑制MMP-9活性的同时，有引起纤维细胞增生及胶原合成增多和过度沉积的作用，从而导致ECM修复和重构。可见MMP-9/TIMP-1失衡是气道重塑并导致COPD急性加重的重要机制之一[17]。目前暂缺关于COPD急性加重期各中医证型的MMP-9、TIMP-1表达情况研究成果[18]。
归肺理气方来源于《汤液本草》与《内外伤辨惑论》，由鱼腥草，黄芩、炙麻黄、杏仁、葶苈子、前胡、紫苏、甘草组成。鱼腥草味辛，微寒，归肺经，具有清热解毒，消痈排脓、利尿通淋功效。《本草纲目》谓：“散热毒痈肿”；《本草经疏》谓：“治痰热壅肺，发为肺痈吐脓血之要药”。紫苏味辛、温，归肺、脾经，具解表散寒功效。麻黄味辛、微苦，性温，归肺、膀胱经，具发汗解表，宣肺平喘、利水消肿之功效。杏仁味苦，微温，归肺、大肠经，具有止咳平喘，润肠通便的作用。葶苈子性寒，归肝、脾、膀胱经，具清热定惊，通络，平喘，利尿之功效。前胡性苦、辛，微寒，归肺经，具有降气化痰、疏散风热之功效。黄芩性苦、寒，归肺、胆、脾、胃、大肠、小肠经。具清热燥湿，泻火解毒功效。甘草性甘、平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气，祛痰止咳，缓急止痛，清热解毒，调和诸药作用。本方君药鱼腥草，具清热化痰，降气平喘功效。方中臣药紫苏、麻黄宣肺解表；同时配以杏仁、前胡化痰平喘。再佐以黄芩清泄肺中郁热，葶苈子泻肺中水气、痰涎，利水消肿，甘草利气以和中，止咳化痰，调和诸药。全方配伍精密，针对痰热壅肺证，共奏镇咳祛痰、降气平喘之功，是传统医学的整体观念及辨证论治体系的充分体现。
本研究显示，归肺理气方可调节痰热壅肺证慢性阻塞性肺疾病大鼠的MMP-9/TIMP-1失衡，可能有一定的改善COPD气道重塑作用，目前暂无中药方剂COPD急性加重期对MMP-9及TIMP-1的作用的临床报道，尤其对于按照COPD中医辨证分型进行中药干预MMP-9/TIMP-1的临床研究暂缺[19-21]。本研究可作为进一步临床研究的基础，为痰热壅肺证慢性阻塞性肺疾病的中西医结合治疗提供参考。
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（收稿日期：2013-06-17）
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