绵羊乳突类圆线虫病的诊断及虫种鉴定

材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂 食盐、碘化钾、碘等均为市售。各种溶液的配制，饱和盐水、卢戈氏碘液配制方法参见文献[2]。

无菌粪汁：取适量羊的新鲜粪便加入适量蒸馏水，搅拌使其混合均匀，然后用纱布滤去粗大的粪渣，滤液在火炉上煮沸2 h灭菌和杀虫[3]。

1.1.2 试验器材 SPX-150B智能型系列生化培养箱，上海将来实验设备有限公司；WF10/18型显微镜，上海兆仪光电科技有限公司。260目锦纶筛兜等均为市售。

1.2 试验方法

1.2.1 临床检查 采用病史调查、临床基本检查法等进行临床检查。

1.2.2 粪便的采集和厌氧保存 粪便采自河南省新乡市某羊场的疑似乳突类圆线虫病的绵羊。在100 mL的塑料杯中放入10粒左右直径8 mm的玻璃珠，加入约85 mL的自来水。加入10 g新鲜粪便，拧紧瓶盖，用力摇动1 min，使粪球破碎，瓶内粪便很快变为无氧状态[3]。将瓶在20 ℃左右保存，7 d后可收集虫卵用于试验。

1.2.3 饱和盐水漂浮法 取粪便10 g，加饱和盐水100 mL，混匀，通过60目铜筛，滤入烧杯中，静置0.5 h，虫卵上浮，用一直径5～10 mm的铁丝圈，与液面平行接触以沾取表面液膜，抖落于载玻片上加盖玻片进行观察，并测量其大小。同法制得载玻片上虫卵经卢戈氏碘液染色后加盖玻片显微镜下观察。

1.2.4 斯陶尔氏虫卵计数法（Stoll’s method） 在一小玻璃容器上（如小三角烧瓶或大试管），在容量56 mL和60 mL处各做一个标记，先取0.4%的NaOH溶液注入容器内至56 mL处，再加入被检粪便使液体升到60 mL处，而后加入一些玻璃珠，振荡使粪便完全破碎混匀，而后以1 mL的吸管吸取液体0.15 mL，滴于2～3张载玻片上，覆以盖玻片，在显微镜下循序检查，统计其中虫卵总数（注意不可遗漏和重复）。因0.15 mL粪液中实际含原粪量是0.01 g，因此所得虫卵总数乘以100即为每克粪便中的虫卵数[4]。

1.2.5 幼虫培养与虫种鉴定

1）绵纶筛兜集卵法：参见文献[4]。此法适用于长度大于60 μm的虫卵，通过处理，粗大粪渣被铜筛扣留，纤细粪渣（直径小于40 μm）和可溶性色素均被冲洗走而使虫卵集中，本试验收集滤液。

2）无菌粪汁法培养：将收集到的虫卵液摇匀后，吸取2 mL于培养皿内，再吸取无菌粪汁0.2～0.5 mL于培养皿内，混匀后贴上标签28 ℃培养箱中培养。

3）羊粪堆丘法培养：按Heiksen[5]、王庆良[6]的方法改良。将新鲜羊粪碾碎并加入适量锯末，搅匀加入自来水保持其湿润，在培养皿上放一张滤纸，将粪便装填成锥形，即粪便样品中间部分稍高于平皿水平面1～2 mm，四周低于平皿水平面10～15 mm，28 ℃培养箱中进行培养。

4）虫种鉴定：虫卵及幼虫经卢戈氏碘液染色后加盖玻片，显微镜下通过观察其形态、大小等进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 临床检查结果

临床可见病羊有不同程度的贫血、消瘦、腹泻症状，感染性幼虫穿过皮肤移行到肺时，常引起湿疹、支气管炎、肺炎和胸膜炎，最后多因极度衰弱而死亡，死亡率可达50%；少量寄生时，临床症状不明显，但影响生长发育。丝虫蚴侵入成年羊体内时常不能发育至性成熟，但病羊及年老体弱羊有时感染。

2.2 饱和盐水漂浮法检查结果

2.2.1 虫卵形态 虫卵形态见图1、图2。显微镜下观察到大量虫卵，虫卵为椭圆形，壳薄，无色透明，虫卵大小为（42～60） μm ×（25～36） μm，且大部分虫卵内含幼胚。

2.2.2 虫卵大小 显微镜下观察虫体的大小有很大差异，其结果见表1。由表1可知，羊粪中长度小于60 μm的虫卵较多，占42%；且虫卵中含有幼胚，初步诊断为乳突类圆线虫。

2.3 斯陶尔氏虫卵计数法结果

斯陶尔氏虫卵计数结果显示每克羊粪中含虫卵1 100个，属于轻度感染。

2.4 幼虫培养和虫种鉴定结果

采用无菌粪汁法、羊粪堆丘法在28 ℃的条件下培养2～3 d均观察到大量幼虫，运动活泼。染色后具体的形态学观察结果见图3。根据以上形态学观察结果，最终确诊为绵羊乳突类圆线虫病。

3 小结与讨论

3.1 病料采集与幼虫的培养

根据临床症状观察以及对所分离的虫卵、孵化的幼虫虫体进行形态学的检测，确认该羊场的羊只所患为乳突类圆线虫病。为了保证试验结果的准确性，虫卵孵化试验中的虫卵必须在从宿主体内排出后3 h内使用；虫卵只能在2～7 ℃保存，否则会影响卵的孵化过程。因为虫卵孵化试验要用新鲜的虫卵，故在野外调查时难度较大。绵羊和山羊粪便中的线虫卵保存通过粪样的厌氧保存可以得到解决[7]。

粪便中的乳突类圆线虫卵大多数在25 ℃温水中经24 h发育为杆虫型幼虫，该幼虫非常活跃，将含有该幼虫的羊粪便经贝尔曼氏幼虫分离时，幼虫在数秒钟内大多进入水中，并向试管下移动[8，9]。如果羊粪便中混杂有其他线虫的幼虫，因是第一期幼虫，运动很慢，在数秒钟内很少能进入水中，即使进入水中，其沉向试管底的时间也较长。因此本试验在1 min内收集的大多为类圆线虫的幼虫。此外类圓线虫丝虫型幼虫形态特异，其尾部有分叉，容易与其他的幼虫区别。集卵后用无菌粪汁进行培养，培养皿底部放一平皿加水来调节湿度，这样就可以少加粪汁，并且注意间隔一定的时间向培养皿内吹新鲜空气[10]。

本试验中羊粪堆丘法用锯末加粪便进行培养不仅可使培养物疏松通气，而且木质的吸水性具有调节培养物湿度的功能，从而保证虫卵发育时所需的空气和水分，进一步提高虫卵发育率。

3.2 乳突类圆线虫发病季节特征

乳突类线圆虫虫卵一年内在羊粪中出现有2个高峰，第一个高峰期在10月，第二个高峰期在5月。虫卵出现的低谷在12月至次年的3月，即整个冬季[11]。本试验中羊粪中的乳突类圆线虫虫卵处于第二个高峰期，这也是做出诊断的依据之一。据此规律，羊场宜在每年春、秋两季用丙硫咪唑驱虫1～2 次，可有效预防该病。

参考文献：

[1] 孔繁瑶.家畜寄生虫学[M].第二版.北京：中国农业大学出版社，1997.

[2] 赵树英.动物寄生虫学[M].第三版.山西太谷：山西农业大学出版社，2005.

[3] COLES G C，何国声.世界兽医寄生虫学促进协会（WAAVP）对驱蠕虫药抗药性的检测方法[J].中国兽医寄生虫病，1996（1）：60-63.

[4]严若峰，徐立新，李祥瑞.捻转血矛线虫纯净3期幼虫制备方法的改进[J].畜牧与兽医，2009（1）：86-88.

[5] HENRIKSEN S A.A method for culture and recovery of gastrontestinal wtrongyle larvae[J].Nord Veter，1983，35：429-430.

[6] 王庆贤.马圆线虫类幼虫培养方法的改进及温度、湿度对幼虫发育的影响[J].中国兽医杂志，1959（7）：217-220.

[7] 张西臣，李建华.动物寄生虫病学[M].北京：科学出版社，2009.

[8] 姚宝安，王乾兰.苏云金芽孢杆菌毒素对羊捻转血矛线虫第三期幼虫毒力研究[J].畜牧兽医学报，1995，26（4）：358-361.

[9] 叶明忠，沈 杰，陈永军.羊乳突类圆线虫在体内及牧场上消长规律的研究[J].湖北畜牧兽医，1994（2）：13-15.

[10] 韩 谦.蒙古马歇尔线虫人工培养及其发育各阶段的形态学研究[D].北京：北京农业大学，1988.

[11] 王治才，徐志光，李建军，等.绵羊粪便中毛圆线虫卵培养和感染性幼虫分离法的比较[J].中国兽医寄生虫病，2004，12（2）：4-6.

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