对甲氧基肉桂醛的抗真菌活性及田间药效分析
摘要
通过对植物香料产物对甲氧基肉桂醛的抗真菌活性研究，发现该化合物对鞭毛菌亚门卵菌纲、子囊菌亚门和半知菌亚门的8种植物病原真菌，番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani AG1 IA）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、草莓褐色轮斑病菌（Phomopsis obscurans）、草莓炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和烟草赤星病菌（Alternaria alternata）具有高效、广谱的特性；田间药效试验表明其对黄瓜霜霉病和水稻纹枯病具有较高的防治效果。这为其在植物病害防治中的应用以及进一步开发提供了依据。
关键词
对甲氧基肉桂醛； 植物香料产物； 抗真菌活性； 田间药效
开发安全性高、残留低、无公害、生物活性高、选择性强的环境友好型杀菌剂成为当今农药发展的趋势和迫切需要。与化学杀菌剂相比，植物源杀菌剂不仅生物活性多样，而且作用方式独特、低残留、与环境相容性好，并易于分解。从植物中寻找具有杀菌抗病活性的物质，特别是具有新型分子结构和特殊作用机理的化合物是当前新型、环保型杀菌剂创制的一条重要途径[1]。
随着人类对环境生态的关注，环境友好型天然产物杀菌剂的研究与开发成为目前全球农药产业的热点。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是一类以天然抗生素stroblurin A 为先导化合物开发的低毒、高效、广谱、安全的新型杀菌剂，自1969年被发现至1996年第一个杀菌剂嘧菌酯进入市场以来，其产品数量迅速增加，并快速发展成为超过三唑类杀菌剂的主流产品之一[25]。这类杀菌剂的活性基团是甲氧基丙烯酸酯/酰胺。
对甲氧基肉桂醛（MCA）是植物香料肉桂（桂皮）的成分之一，是从天然食用香料植物肉桂（Cinnamomum cassia）中提取或由人工合成制得（与天然的MCA系同一物）的单体化合物，主要用于医药制造和食用香精香料等，属于甲氧基苯基丙烯醛类化合物。目前，国内外尚未见到MCA应用于农作物病害防治的相关报道和专利。本研究旨在通过分析植物香料产物MCA抗真菌活性及其田间药效，为其在农作物病害防治中的应用以及进一步开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试药剂：99%对甲氧基肉桂醛纯品（武汉远城科技发展有限公司提供）； 250 g/L嘧菌酯悬浮剂（瑞士先正达作物保护有限公司，azoxystrobin）；20%井冈霉素可溶性粉剂（浙江钱江生物化学股份有限公司）。
供试病原菌：番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani AG1 IA）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、草莓褐色轮斑病菌（Phomopsis obscurans）、草莓炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、玉米茎腐镰刀菌（Fusarium spp.）、番茄叶霉病菌（Cladosporium fulvum）、梨黑斑链格孢（Alternaria gaisen）和棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）均为上海市农业科学院植物保护研究所植物病理实验室鉴定并保存菌株。
供试作物：黄瓜品种为‘沪杂5号’，由上海市农业科学院设施园艺研究所提供；水稻品种为‘武育粳3号’，由上海市农业科学院作物育种栽培研究所提供。
1.2 试验方法
1.2.1 室内毒力试验
采用室内离体平皿法测定MCA对植物病原真菌的抗菌谱及其抗菌活性。先将99%MCA纯品用无水乙醇溶解后制成母液，然后与PDA培养基依次配制成含6.25、12.5、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL MCA系列浓度的平板培养基，以不含MCA的PDA为空白对照，每处理4次重复。将培养3 d的病菌菌饼（直径5 mm）置于各浓度含药培养基上，分别在16℃或25℃的恒温箱内培养，待CK的菌落长至近全皿时测量菌落直径，并计算菌丝生长抑制率、毒力回归方程和有效抑菌中浓度（EC50）。 抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。
1.2.2 田间小区试验
1.2.2.1 防治黄瓜霜霉病的田间小区试验
参照农药部农药检定所农药田间药效试验准则设计本试验[6]。试验采用随机区组排列，每小区面积10 m2，每处理4次重复。黄瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）为田间自然发病菌。设置5个处理： 3个MCA有效剂量处理（200、400、800 μg/mL），1个对照药剂（400 μg/mL 嘧菌脂）和清水对照处理。在田间黄瓜霜霉病发病初期，每隔7 d全株喷雾1次，每次500 mL，共施药3次。每次施药后7 d调查病情级数，并观察各处理对黄瓜生长有无影响（药害），计算病情指数和防治效果。试验结果采用SAS 9.0统计软件进行统计分析。
每小区随机取4点调查，每点调查2株，调查全部叶片，分级标准（以叶片为单位）[6]为：0级，叶片无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积≤5%；3级，病斑面积占整个叶面积6%～10%；5级，病斑面积占整个叶面积11%～20%；7级，病斑面积占整个叶面积21%～50%；9级，病斑面积占整个叶面积50%以上。
1.2.2.2 防治水稻纹枯病的田间小区试验
参照张穗等的方法设计本试验[7]。采用随机区组排列。设置5个处理： 3个MCA浓度处理（50、100、200 μg/mL），1个对照药剂处理（100 μg/mL 井冈霉素）和1个清水对照处理。对分蘖末期的水稻进行全株喷雾，喷药后第1、7、14天分别将培养3 d的水稻纹枯病菌菌饼（直径5 mm）夹在水稻上数第3个叶鞘内。每处理3次重复，每个重复30～50株水稻，并用保鲜袋保湿5 d，接种后第7天测量各处理的病斑扩展长度（cm），计算相对防治效果，并对各处理之间的防治效果进行差异显著性检验。试验结果采用SAS 9.0统计软件进行统计分析。
防治效果（%）=
对照病斑扩展长度-处理病斑扩展长度对照病斑扩展长度×100。
2 结果与分析
2.1 对甲氧基肉桂醛（MCA）对植物病原真菌的毒力测定结果
室内毒力测定结果（表1）表明，番茄晚疫病菌（P.infestans）对MCA最为敏感，水稻纹枯病菌（R.solani AG1 IA）次之。MCA对这两种菌的EC50分别为17.26和18.26 μg/mL，EC80分别为66.35和96.17 μg/mL，其毒力作用的理论浓度明显低于对照药剂嘧菌酯防治上述植物病原真菌的田间用药浓度；MCA 对油菜菌核病菌（S.sclerotiorum）、西瓜枯萎病菌（F.oxysporum）、番茄灰霉病菌（B.cinerea）、草莓轮斑病菌（P.obscurans）和草莓炭疽病菌（C.gloeosporioides）和烟草赤星病菌（A.alternata）的EC50在74.80～161.55 μg/mL之间，EC80在182.62～362.49 μg/mL之间（表1），其毒力作用的理论浓度均与对照药剂嘧菌酯防治上述病原真菌的田间用药浓度相当。MCA对玉米茎腐镰刀菌（Fusarium spp.）、番茄叶霉病菌（C.fulvum）、梨黑斑链格孢（A.gaisen）和棉花黄萎病菌（V.dahliae）的EC50在163.54～267.5 μg/mL之间，EC80在527.851～727.10 μg/mL之间，其毒力作用的理论浓度高于对照药剂嘧菌酯防治上述植物病原真菌的田间用药浓度（表1）。在室内毒力测定的12种植物病原真菌中，MCA对8种重要的农作物病原真菌显示出很高的抗菌活性，且分别来自于鞭毛菌亚门卵菌纲、子囊菌亚门和半知菌亚门。
2.2 田间小区试验
2.2.1 对甲氧基肉桂醛（MCA）防治黄瓜霜霉病的田间药效
田间药效试验表明， 400、800 μg/mL MCA在第1次喷药后第7天对黄瓜霜霉病的田间防治效果分别为69.9%和67.3%，均与对照药剂250 g/L嘧菌酯悬浮剂400 μg/mL的防治效果（69.3%）差异不显著，且对黄瓜的生长无影响。200 μg/mL MCA对黄瓜霜霉病的效果不佳，防效仅为35.8%（表2）。综合有效浓度和防效，认为400 μg/mL MCA 防治黄瓜霜霉病与嘧菌酯的效果相当。
2.2.2 对甲氧基肉桂醛（MCA）对水稻纹枯病的田间药效
喷施50、100、200 μg/mL MCA后1、7 d接种水稻纹枯病菌，其防治效果均随着浓度的增高而提高，其中喷施100、200 μg/mL MCA 后1 d接种对水稻纹枯病菌的防治效果分别为57.9%、65.0%，均与对照药剂20%井冈霉素可溶性粉剂100 μg/mL处理后的病斑扩展长度的差异不显著；喷药后第7 天接种，其防效分别为54.3%、68.2%，亦均明显高于井冈霉素100 μg/mL的防效（41.6%）；在喷药后第14天接种，两个浓度处理的防治效果下降至30.4%、25.3%，但仍然显著高于井冈霉素100 μg/mL的防效（8.0%）。喷施50 μg/mL MCA后1 d接种，MCA的防效（38.9%）明显低于井冈霉素100 μg/mL处理（66.6%），但在喷药后第7、14 天接种，其防治效果分别为41.7%和35.3%，并未明显下降。从以上结果可以看出200 μg/mL MCA对水稻纹枯病具有较强的防治效果，且与20%井冈霉素可溶性粉剂的防治效果相当，但有效浓度高于井冈霉素1倍。随着施药后天数的增加，MCA对水稻纹枯病的防治能力虽均有所下降，但在施药后14 d接种，仍具有一定的防治效果，表现出较长的持效性（表3）。
3 结论与讨论
本研究发现了植物香料成分之一对甲氧基肉桂醛（MCA）的新用途：1）该化合物对鞭毛菌亚门卵菌纲、子囊菌亚门和半知菌亚门的8种重要的农作物病原真菌[番茄晚疫病菌（P.infestans）、水稻纹枯病菌（R.solani AG1 IA）、油菜菌核病菌（S.sclerotiorum）、西瓜枯萎病菌（F.oxysporum）、番茄灰霉菌（B.cinerea）、草莓轮斑病菌（P.obscurans）、草莓炭疽病菌（C.gloeosporioides）和烟草赤星病菌（A.alternata）]具有高效、广谱的抑制作用。室内毒力测定发现MCA 对这8种病原真菌的有效剂量理论浓度EC80均低于或相当于对照药剂250 g/L嘧菌酯悬浮剂防治同种植物病原真菌的田间用药浓度。2）田间小区试验表明，400、800 μg/mL MCA对黄瓜霜霉病的防治效果与相同浓度的对照药剂250 g/L嘧菌酯悬浮剂差异不显著。3）200 μg/mL MCA对水稻纹枯病防治效果高于20%井冈霉素可溶性粉剂100 μg/mL的防效或与之相当，且药效可持续14 d以上。
以上研究为今后MCA在农作物真菌病害防治方面的应用提供了重要的依据。
目前，可以人工合成对甲氧基肉桂醛的化合物单体[8]，且生产成本低廉，这为其大面积推广应用提供了可能。揭示MCA的抗菌活性及田间药效，对于今后农业生产中减少对进口杀菌剂嘧菌酯等的依赖，降低生产成本，保护农业生态环境安全和确保作物稳产高产等具有重要的现实意义。
应加快MCA杀菌机理、作用方式、环保型剂型、毒理和残留分析以及病原物的抗药性等方面的基础研究，以加快推进其产业开发的进程和推广应用的力度。
参考文献
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[6] 国家质量技术监督局. 农药田间药效试验准则（一）杀菌剂防治黄瓜霜霉病GB/T 17980.262000 [S].北京： 中国标准出版社 2000.
[7] 张穗， 郭永霞， 唐文华， 等. 井冈霉素A对水稻纹枯病菌的毒力和作用机理研究[J]. 农药学学报， 2001， 3（4）： 3137.
[8] 叶思， 叶传发. 一种3甲氧基肉桂醛的工业制备方法： 中国， CN102992981A [P]. 2013327.
（责任编辑：杨明丽）