抗咯菌腈禾谷镰刀菌的紫外诱导及其生物学特性

材料和方法

1.1 材料

供试菌株：禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）菌株来自吉林省农业科学院植物保护研究所病虫害综合防治研究室。

供试药剂：95%咯菌腈原药，杭州宇龙化工有限公司；甲醇，北京化工厂；10%苯醚甲环唑水分散颗粒剂，先正达中国投资有限公司；60 g/L戊唑醇种子处理悬浮剂，拜尔作物科学有限公司；250 g/L嘧菌酯悬浮剂，河北威远生物化工股份有限公司。上述化学杀菌剂中制剂用灭菌蒸馏水、原药用甲醇分别溶解配制。

仪器：恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；8 W紫外灯。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g，加蒸馏水至1 000 mL；CMC培养基：羧甲基纤维素钠15 g、硝酸铵 1 g、磷酸二氢钾 1 g、七水硫酸镁 0.5 g、酵母提取物 1 g、琼脂粉 15 g，加蒸馏水至1 000 mL；SNA培养基：磷酸二氢钾 1 g、硝酸钾1 g、七水硫酸镁 0.5 g、氯化钾 0.5 g、葡萄糖 0.2 g、蔗糖 0.2 g，加蒸馏水至1 000 mL；水琼脂培养基为2%的琼脂培养基。所有培养基均经121℃ 高压灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 咯菌腈对禾谷镰刀菌的毒力测定

采用菌丝生长速率法测定咯菌腈对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制作用，咯菌腈的浓度设置为：0、3、1、0.5、0.125和0.062 5 μg/mL。在禾谷镰刀菌菌落边缘打取直径为5 mm的菌盘，接种在含有咯菌腈的PDA培养基中央，以添加相应量甲醇为对照，25℃黑暗培养5 d，十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3皿，试验重复2次。

1.2.2 禾谷镰刀菌抗咯菌腈突变体的紫外诱导

将禾谷镰刀菌接种在CMC培养基上，培养7 d，待其大量产生分生孢子，将培养皿盖打开，放置在距离8W紫外灯20 cm处照射5 min，经双层纱布过滤制备成1×107个/ mL的分生孢子悬浮液，取200 μL均匀涂布于含有0.3 μg/mL 咯菌腈的培养基上，25℃黑暗培养2 d，将萌发的抗性菌株在不含咯菌腈的PDA培养基上连续培养5代，并测定含有0.3 μg/mL 咯菌腈的培养基上生长速度较快的突变体（同1.2.1方法）对咯菌腈的敏感性，计算抗性突变频率和抗性倍数。

抗性突变频率=抗性突变菌株数/涂板的分生孢子总数量；

抗性倍数=抗性突变体的EC50值/亲本菌株的EC50值。

1.2.3 抗性遗传稳定性测定

随机选取5株紫外诱变获得的抗性突变体进行测定。将5株抗性突变体在PDA培养基上继代培养9代，25℃黑暗培养5 d，通过测量菌落直径法测定咯菌腈对抗性菌株后代的EC50，计算其抗性倍数，并根据抗性菌株的生长速度确定其遗传稳定性。

1.2.4 抗性突变菌株的生物学特性研究

1.2.4.1 温度对抗性突变菌株的影响

选取5株能稳定遗传的抗性突变菌株及其亲本菌株，于25℃培养3 d，自菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，接种在不含咯菌腈的PDA培养基上，分别于5、15、20、25和32℃培养箱中培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次，试验重复2次。

1.2.4.2 pH对抗性突变菌株的影响

用盐酸或氢氧化钠溶液调节不含咯菌腈的PDA培养基的pH分别为4、6、7、8和10，分别接种直径5 mm的预培养菌落边缘菌饼，于25℃培养3 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次，试验重复2次。

1.2.4.3 NaCl对抗性突变菌株的影响

将直径5 mm的咯菌腈抗药突变体和亲本菌株的菌碟接种在含0、0.1、0.3、0.7和0.9 mmol/L NaCl的PDA平板上，25℃黑暗培养5 d，测量菌落直径，观察菌落形态。

1.2.5 抗性突变体对其他药剂的敏感性测定

采用菌丝生长速率法，分别测定出发菌株和7株抗咯菌腈的突变菌株对戊唑醇、苯醚甲环唑和嘧菌酯的敏感性，并利用DPS软件计算亲本菌株及抗性菌株对其他药剂的EC50。

1.3 数据分析

采用DPS 7.0统计软件进行数据处理，计算药剂的毒力回归方程及EC50。

2 结果与分析

2.1 紫外诱导抗药性

研究发现咯菌腈对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制作用回归方程为y=0.946+1.087x，EC50为0.016 μg/mL，EC95为0.529 μg/mL。通过紫外线诱导获得17株抗性菌株，抗药性分析发现抗性菌株对咯菌腈的抗性倍数为4 000～17 000倍（表1），当咯菌腈的浓度为500 μg/mL时，对抗性突变菌株的抑制率为52.2%～83.1%，表明野生型菌株经紫外线诱导可产生对咯菌腈高抗突变菌株，抗性突变频率为1.7×10-6。

2.2 抗性菌株的遗传稳定性

由表2可知，经紫外诱导的5株抗性突变体在无药的PDA培养基上继代培养9代后， 第1代和第9代的菌落生长速度无明显差异，对咯菌腈的EC50也无明显变化，表明室内紫外诱导获得的抗咯菌腈突变体可稳定遗传。

2.3 抗性突变菌株的生物学特性

2.3.1 温度对抗性突变菌株的影响

由图1可见，亲本菌株和抗性突变菌株在不同温度条件下培养3 d菌丝生长速率变化趋势一致；最适温度均为25℃；在4℃和32℃条件下，亲本菌株和抗性突变菌株几乎不能生长；在相同温度下，抗性突变菌株菌丝生长速率均慢于亲本菌株。表明抗性突变菌株对温度的敏感性与亲本菌株相同。

2.3.2 pH对抗性突变菌株的影响

分析不同pH的PDA培养基对亲本菌株和抗性突变菌株菌丝生长速率的影响，结果发现，亲本菌株和抗性突变菌株在不同pH的PDA培养基中的生长速率变化趋势是一致的；最适pH均为8；在相同pH的条件下，抗性突变菌株菌丝生长速率均小于亲本菌株；4号突变菌株的菌丝生长速率在pH 4和6时，明显慢于亲本菌株，pH为7和8时与亲本菌株相近（图2）。表明抗性突变菌株对pH的适应性与亲本菌株相似，4号突变菌株对pH的适应性略有增强。

2.3.3 渗透压对抗性突变体的影响

试验表明，亲本菌株和抗性突变体在含有高浓度NaCl的PDA培养基中生长没有受到抑制。在0.9 mmol/L 的NaCl渗透压条件下，亲本菌株和4号抗性突变体的菌落形态无明显变化，但1号和16号抗性突变体培养基中红色素的沉积明显增加。说明亲本菌株和对咯菌腈抗性较低的突变体在增加渗透胁迫条件下生长受到抑制，而抗性较强的突变菌株对渗透胁迫不敏感。

2.4 禾谷镰刀菌对其他药剂的抗药性

紫外诱变获得的7株抗咯菌腈突变菌株对苯醚甲环唑的抗性明显低于亲本菌株，对戊唑醇和嘧菌酯的抗性高于亲本菌株，表明紫外诱导禾谷镰刀菌突变不仅对咯菌腈抗性增强，对嘧菌酯的抗性也增强，紫外诱导禾谷镰刀菌突变可导致多重抗药性发生（表3）。

3 讨论

咯菌腈是一种通过抑制丝裂原活化蛋白激酶/组氨酸激酶磷酸化导致病菌死亡的杀菌剂，已广泛应用于防治农业生产中的真菌病害[1415]。有关该药剂的抗药性问题也有大量报道，如核盘菌抗性菌株对咯菌腈的抗药性达到敏感菌株的2 000倍以上，具有较高的抗性风险[16]；番茄灰霉病菌对咯菌腈的抗药性是亲本菌株的310倍以上，抗性风险较低[17]；马铃薯早疫病菌对咯菌腈高度敏感，但不同地区的马铃薯早疫病菌对咯菌腈的EC50相差34.87倍[18]，以上研究结果表明，不同病原菌对咯菌腈的敏感性不同，且抗性风险也不相同。本研究发现禾谷镰刀菌对咯菌腈具有高度的敏感性，EC50仅为0.016 μg/mL，通过紫外诱导获得17株突变体对咯菌腈表现了较强的抗药性，表明紫外照射可诱导禾谷镰刀菌产生对咯菌腈抗药性增强的突变体。李恒奎等[13]研究发现紫外诱导禾谷镰刀菌产生抗氰烯菌酯的突变体，继代培养8代后其抗药性可稳定遗传；周明国等[19]研究发现禾谷镰刀菌对多菌灵的抗性可稳定遗传。本研究发现抗性突变体继代培养9代对咯菌腈的抗性水平未发生明显变化，可稳定遗传，推测禾谷镰刀菌若突变为抗性菌株对多种化学药剂的抗性均可稳定遗传。

然而美国分离的112株禾谷镰刀菌中对咯菌腈的敏感性差异非常大，100 μg/mL的咯菌腈对抗性菌株的抑制率小于20%，且抗性菌株的致病力没有减弱，表明在美国田地中已经存在抗咯菌腈菌株[20]。本研究经室内诱变获得了高抗咯菌腈的突变菌株，表明禾谷镰刀菌经紫外照射后会产生对咯菌腈抗性增强的突变菌株。然而在我国的田地中高抗咯菌腈的禾谷镰刀菌是否已经出现尚需要采集我国不同地区的禾谷镰刀菌进行药剂敏感性测定。

杀菌剂的大量、连续、广泛使用不仅会造成田间植物病原菌对其产生抗药性[21]，还会导致突变菌株对其他药剂的抗性增强，研究报道戊唑醇与百菌清复配可增加对禾谷镰刀菌的抑制效果；戊唑醇与多菌灵复配可破坏禾谷镰刀菌抗性菌株细胞的渗透性[2223]。然而关于禾谷镰刀菌对多菌灵、戊唑醇和氰烯菌酯的抗性报道较多[11，13，19]，对两种或多种药剂的抗性未见报道。本研究发现紫外诱导禾谷镰刀菌突变不仅对咯菌腈抗性增强，对嘧菌酯的抗性也增强，表明紫外诱导禾谷镰刀菌突变可导致多重抗药性发生。潘以楼等研究发现草莓灰霉病菌对多菌灵、腐霉利和乙霉威等药剂产生多重抗药性[24]，然而紫外照射导致禾谷镰刀菌多重抗药性出现的机理有待进一步研究。

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（责任编辑：田 喆）

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